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黑色素瘤是严重威胁人类健康的疾病,其昂贵的治疗费用给患者家庭造成巨大的经济负担。科研工作者一直致力于开发各种肿瘤治疗方法,其中,基于细胞膜的仿生纳米载药递送系统的设计尤其受到关注,它因具有生物相容性好、无毒和免疫原性低等特点成为纳米药物研究的热点。本课题利用“取之于体,用之于体”和“免疫欺骗”的思路构建了一种具有肿瘤靶向性的仿生纳米载药递送系统,通过联合声动力疗法(Sonodynamic therapy,SDT)、化学疗法和免疫学疗法发挥抗肿瘤作用。该仿生纳米载药递送系统具有以下优势:(1)pH敏感和超声响应特性使该系统能够远程控制药物释放;(2)级联式声动力-化学疗法协同免疫学疗法能够有效抑制黑色素瘤生长,且对正常组织没有明显的毒副作用;(3)细胞膜的仿生特性能够降低系统的免疫原性,从而躲避免疫系统的识别和清除,提高仿生纳米载药递送系统的生物相容性;(4)融合血小板膜靶向识别肿瘤部位和红细胞膜延长体内循环时间的特性,并结合肿瘤部位增强的渗透和肿瘤滞留效应(Enhanced Permeability and Retention,EPR)效应,能够显著提高抗肿瘤药物的肿瘤递送效率,增强黑色素瘤治疗效果。1.Lipo-Ce6/TPZ@MH的制备与表征。首先,选用薄膜分散法制备脂质体,将二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6)和替拉扎明(Tirapazamine,TPZ)同时负载在脂质体的磷脂外壳和水相内核中,得到Lipo-Ce6/TPZ;然后从小鼠眼眶中取血,分离出红细胞膜和血小板膜并进行融合得到复合膜;最后在脂质体挤压器上将复合膜与脂质体共挤压,获得新型脂质体Lipo-Ce6/TPZ@MH。以粒径和包封率为指标,优化制备脂质体的最佳条件。透射电子显微镜结果显示脂质体为均匀的球形,细胞膜包覆在脂质体表面后呈现典型的核壳结构,粒径大约90 nm;紫外可见吸收光谱图上同时具有660 nm和265 nm的吸收峰,这与Ce6和TPZ的特征吸收峰一致;体外药物释放结果表明仿生纳米载药递送系统的pH响应特性较好;稳定性实验结果说明细胞膜的包裹可以增加制剂的稳定性;共定位实验结果证明细胞膜成功包覆在脂质体表面;聚丙烯酰胺凝胶电泳实验表明得到的仿生纳米载药递送系统成功地将细胞膜上的蛋白转移至脂质体表面。2.Lipo-Ce6/TPZ@MH的体外抗肿瘤活性。以黑色素瘤B16F10细胞为模型,评估Lipo-Ce6/TPZ@MH联合超声刺激的体外抗肿瘤效果。细胞摄取实验结果表明血小板膜可以增加肿瘤细胞对仿生纳米载药递送系统的摄取率,但细胞膜内在的生物相容性和免疫逃避能力可以降低巨噬细胞对仿生纳米载药递送系统的摄取率;细胞毒实验结果说明空白纳米载药递送系统的生物安全性高,Lipo-Ce6/TPZ@MH(药物浓度Ce6:2μg/mL,TPZ:0.75μg/mL)在US作用下的抑制率约为58%,明显高于其它组,这与细胞凋亡结果一致,能够较好的说明仿生纳米载药递送系统明显的抑瘤效果;ROS/乏氧检测结果表明Lipo-Ce6/TPZ@MH联合超声作用可以产生ROS和乏氧环境,有助于TPZ发挥药效;细胞表面免疫原性标志物钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的表达检测结果表明Lipo-Ce6/TPZ@MH组细胞的CRT表达量最高,说明声动力学治疗能够引发较强的免疫原性细胞死亡。Western blotting实验结果表明声动力学治疗方法能够影响肿瘤细胞内Bcl-2/Bax值。综上,细胞实验结果表明声动力学疗法协同化学疗法和免疫学疗法可以有效抑制黑色素瘤细胞的增殖,具有显著的体外抗肿瘤活性。3.Lipo-Ce6/TPZ@MH的体内抗肿瘤活性。以C57小黑鼠为动物模型,对Lipo-Ce6/TPZ@MH在体内的组织分布、体内药效学、切片染色等方面进行了考察。荷4T1细胞的BALB/c小鼠的活体成像结果表明,在给药4 h后肿瘤部位较高的荧光信号强度说明血小板膜表面的P-selectin对肿瘤细胞表面的CD44受体的靶向作用,7 d后肿瘤部位仍然明显的荧光信号说明红细胞膜可以延长体内循环。小黑鼠的组织分布结果与活体成像结果一致,显示了Lipo-Ce6/TPZ@MH载药系统在血小板膜的靶向和红细胞膜的长循环作用下肿瘤部位的富集量明显增加,药物的生物利用度显著提高。体内药效学主要通过相对肿瘤的体积变化、小黑鼠体重变化、黑色素瘤的H&E染色、TUNEL染色和免疫荧光染色等方面进行考察,结果显示在各给药组小黑鼠体重均未下降,这说明该系统具有生物安全性;免疫荧光染色的实验结果表明Lipo-Ce6/TPZ@MH能够在超声条件下引发较强的机体免疫反应。体内抗肿瘤实验结果表明Lipo-Ce6/TPZ@MH载药递送系统可以靶向递送到肿瘤部位并有效地治疗黑色素瘤。