研究背景：恶性肿瘤是人类面临着一个极大的公共卫生问题,据报道我国平均每天有8550人被诊断为恶性肿瘤,约7300人死于恶性肿瘤,而且这些数据有增加的趋势。恶性肿瘤发病机制的复杂性,给诊断和治疗带来了困难,早期诊断与治疗仍是防治恶性肿瘤的最好方法。目前恶性肿瘤的治疗主要还是化疗,放疗,外科手术等传统方法。随着新技术的不断发展,新型疗方法吸引广大研究者的兴趣,其中包括基因治疗。基因治疗是将外源的遗传物质(DNA或者RNA)导入到靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常,以达到治疗基因相关性疾病目的。研究发现恶性肿瘤的发生发展过程与某些相关基因的过表达或低表达相关,通过抑制或者促进相应的基因的表达可以抑制肿瘤的生长和侵袭并促进肿瘤细胞凋亡到达治疗肿瘤的目的。1998年,Andrew Z.Fire等在秀丽隐杆线虫中进行反义RNA抑制实验时发现RNA干扰,并与2006年获得诺贝尔奖。RNA干扰的发现为基因治疗开辟了一个的新技术手段。RNA干扰是采用双链RNA诱导特异的目标基因沉默,如siRNA和microRNA。siRNA在这个沉默基因的过程中发挥着重要的作用。siRNA为21-25bp的双链RNA,与RISC结合后指导降解特异的mRNA通过碱基互补配对的原则。通过将外源性siRNA导入到恶性肿瘤内,抑制与恶性肿瘤发生发展相关的基因表达,成为一项研究非常热门的基因治疗手段之一。siRNA可以通过化学合成法在体外合成,因此可以根据目标基因的序列设计特定的序列沉默基因。然而siRNA本身性质有限制了该技术的发展和应用,如分子量大和带负电荷阻碍了siRNA穿过细胞膜进入细胞,siRNA在极易被环境中的核糖核酸酶降解在进入细胞前。即使siRNA被载体投进细胞内,然而一般都是通过内吞途径,因此溶酶体或者内吞体也是一个很大的障碍,因为siRNA发挥基因沉默功能是在胞浆中的。设计和构建良好载体或投递系统是发展siRNA用于恶性肿瘤基因治疗的新一个课题。siRNA载体或者投递系统一般具有以下特点①能够将siRNA稳定的组装到载体或者投递系统上,②合成或者组装方法简单,③载体或者投递系统可以穿过细胞膜进入细胞,④逃逸溶酶体的降解,⑤保护siRNA不被环境中核糖核酸酶降解,⑥低毒性,⑦在进入细胞后可以释放siRNA。纳米载体技术的发展,为siRNA应用带来了希望。纳米载体技术是将药物、小分子、基因等组装到纳米材料上,达到增加生物膜的通透性、提高生物利用度、调节释放速度以及改变药物体内的分布。设计和构建siRNA纳米载体极大的吸引研究者的兴趣。金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、磁性纳米颗粒、脂质纳米粒子、聚合物纳米粒子、适配体等纳米材料均己被设计组装成siRNA载体。但是这些纳米载体的合成方法是比较复杂,往往需要经过多步复杂的物理或者化学方法才能合成；合成后的载体往往也不能完全解决siRNA所面临的问题。这些问题阻碍了siRNA运用到临床。寻找合适的纳米材料,并通过简单的方法组装载体系统,并将siRNA成功投递到目标细胞,高效沉默目标基因,是本研究的重点。单壁碳纳米管(singe wall carbon nanotube,SWCNT)已经广泛的被研究,在材料的制备、生物医学等领域。研究发现SWCNT也是可以作为siRNA载体,通过一定的化学修饰形成功能化的SWCNT,siRNA再通过共价键或者非共价键的方式和这些功能化的SWCNT相结合。但是功能化的SWCNT一般是比较难合成的,合成效率也是非常低的。通过共价键结合后,siRNA在细胞内是比较难释放的。为建立以SWCNT为中心的siRNA投递系统以及解决上述问题,本研究设计了一个简便的合成方法。本研究选择了穿膜肽(cell penetrating peptide,CPP),序列为NH2-VGAAvVvWlWlWl WbA-GSG-PKKKRKVC-COOH。这段序列包括三部分,分别是疏水端NH2-VGAlAvVvWlWlWlWbA,连接端GSG以及正电荷端PKKKRKVC-COOH。通过简单的两步法,可以将siRNA和CPP与SWCNT成功的组装成一个载体系统。首先,在室温的条件下让带负电荷的siRNA和CPP的正电荷端通过静电作用结合形成siRNA-CPP复合物；再者,在超声的作用下让siRNA-CPP通过疏水作用结合到SWCNT表面形成投递系统siRNA-CPP-SWCNT。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin,mTOR)是一种保守的丝-苏氨酸蛋白激酶,属于P13K激酶相关激酶超家族成员。研究发现,在许多肿瘤中mTOR都被高度激活,雷帕霉素、雷帕霉素衍生物等抑制mTOR可以治疗肝癌、卵巢癌、白血病、肾癌、肝癌、胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、非小细、胞肺癌、膀胱癌等多种肿瘤。因此本研究选择mTOR-siRNA (正义链：CUGAGU ACG UGGAAU UUG AdTdT;反义链：UCA AAU UCC ACG UACUCA GdTdT)。目的：1.设计和构建siRNA纳米载体siRNA-CPP-SWCNT,建立该纳米载体体系的最简便合成方法并对载体的粒径,形貌、稳定性等性质进行研究。2.进一步在细胞外和细胞水平研究纳米载体siRNA-CPP-SWCNT的特殊性质,如纳米载体的核糖核酸酶降解研究、细胞毒性研究、细胞内追踪siRNA实验、siRNA投递效率等。3.设计合成mTOR siRNA,将其组装到纳米载体上并导入细胞内,研究siRNA对目标基因沉默以及基因沉默后恶性肿瘤细胞的生长情况。方法：1.纳米载体的合成。首先,设计合成穿膜肽包括三个部分,疏水端为NH2-VGAlAvVvWlWlWlWbA,连接部分为GSG和正电荷端为PKKKRKVC-COOH。siRNA带负电荷,因此siRNA和CPP可以通过静电作用结合在一起。将8nmol CPP和2nmol siRNA溶解到100μl DEPC处理水中,震荡1min后在室温放置30min可以行siRNA-CPP复合物。其次,采用超声作用使siRNA-CPP通过疏水作用结合到SWCNT。将0.0005mg SWCNT加入到siRNA-CPP溶液中,在冰浴中利用超声作用60min在输出功率为40W情况下。通过10000g离心30min和透析48h分别出去溶液中没有结合SWCNT和siRNA、 CPP、siRNA-CPP。最终得到溶液即含有复合物siRNA-CPP-SWCNT.2.纳米载体的表征。纳米材料合成后一般需要对粒径、外貌、稳定性进行研究。本研究中分别采用动态散射粒度分析仪、原子力显微镜、琼脂糖凝胶电泳等技术和手段对上述性质进行测量,表征和分析。3.纳米载体的核糖核酸酶降解。将2μL的RNase(5U mL-1)加入到含有0.5μg siRNA的siRNA、siRNA-CPP和siRNA-CPP-SWCNT溶液中,在37℃C水浴中反应1h。反应结束后将各组分成两等分,一份加入足量的肝素钠(100000units/mL,10mL肝素钠mg/siRNA)使siRNA从纳米载体中释放下来。将上述的六个样品进行琼脂糖凝胶电泳分析siRNA的含量,通过含量来分析siRNA的降解情况。4.细胞毒性实验。采用CCK-8对不同浓度不同时间siRNA-CPP与siRNA-CPP-SWCNT处理Hela后的毒性检测。5.细胞内追踪siRNA。将绿色荧光FAM(ex:488nm)标记到siRNA的5’端用于在细胞内追踪siRNA的分布。首先将100nM的siRNA, siRNA-CPP和siRNA-CPP-SWCNT与贴壁生长24h后的Hela细胞共培养12h,并用Hoechst33342标记细胞核。采用激光共聚焦显微镜追踪荧光分布来反应siRNA进入细胞的分布。其次,用LysoTracker Red标记溶酶体,研究siRNA进入细胞后能否逃逸溶酶体。6.siRNA的投递效率。同样合成siRNA标记上FAM,100nM的siRNA, siRNA-CPP和siRNA-CPP-SWCNT与贴壁生长24h后的Hela细胞共培养12h,收集细胞利用流式细胞仪进行分析和统计7.目标基因沉默。采用western blotting和Real time PCR对siRNA沉默目标基因进行研究。将100nM的siRNA, siRNA-CPP和siRNA-CPP-SWCNT与贴壁生长24h后的Hela细胞共培养48h后,收集细胞,用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白用于western blotting分析蛋白的表达情况。共培养24h后,用Trizol法提出mRNA,逆转录后进行Real time PCR分析mTOR mRNA的相对含量来分析mRNA的降解情况。8.恶性肿瘤生长情况。Annexin-V FITC-与PI联合标记细胞后,流式细胞仪可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。将纳米载体系统siRNA-CPP-SWCNT与贴壁生长24h后的Hela细胞共培养48h后,收集细胞。按照nnexin V-FICT/PI双染细胞凋亡检测试剂盒上说明方法对细胞进行染色,染色后用流式细胞仪进行分析。9.统计学分析。以上实验均设有阴性对照实验,每次实验至少重复3次,结果最后用平均数和方差表示。统计学差异分析均用t-检验。结果：1.成功构建siRNA纳米载体,仅仅需要两步,首先通过siRNA和CPP之间的静电作用结合形成siRNA-CPP以及siRNA-CPP在超声作用下通过疏水作用结合到SWCNT上形成siRNA-CPP-SWCNT。通过粒径分析,形貌观察以及稳定性研究,证明siRNA-CPP成功缠绕到SWCNT上形成稳定的复合物siRNA-CPP-SWCNT.2. siRNA-CPP-SWCNT暴露在含有核糖核酸酶的环境中,通过琼脂糖凝胶电泳分析被降解后siRNA含量,显示纳米载体能够较好的保护siRNA免受核糖核酸酶降解在CPP和SWCNT协助下。3.细胞毒性试验显示纳米载体siRNA-CPP-SWCNT在一定时间和浓度范围内是低毒的。4.利用激光共聚焦显微镜对标记绿色荧光的FAM-siRNA进行追踪,发现siRNA成功投递到细胞内,同时也发现与对siRNA-CPP组比较时siRNA-CPP-SWCNT组投递效率较高。并通过流式细胞仪进一步验证,结果和上述一致,并发现siRNA-CPP-SWCNT投递效率可以达到98%(98%的细胞被荧光标记,表明siRNA可以被98%的细胞摄取)。在溶酶体与FAM-siRNA共定位试验中,发现在siRNA-CPP组中虽然能将siRNA投递进入细胞,但是大部分进入溶酶体,然而在siRNA-CPP-SWCNT组中不仅能够将siRNA投递进入细胞内,而且发现细胞胞浆内也有逃逸溶酶体的siRNA,表明在CPP和SWCNT的协助下siRNA逃逸了溶酶体到达了胞浆。5.western blotting和PCR验证了被投递到胞浆的siRNA很好的沉默目标基因mTOR。两实验结果显示mTOR的表达量下降是通过降解mTOR siRNA实现的。大约70%的mRNA被降解,这也表明该纳米载体是高效率的。6.siRNA-CPP-SWCNT处理后的恶性肿瘤的细胞凋亡通过流式细胞仪分析,与对照组比较发现其可以抑制细胞生长,促进细胞凋亡和死亡。。结论：在这项研究中,通过一个简单的方法合成的稳定的siRNA纳米投递系统siRNA-CPP-SWCNT。一系列的研究表明,siRNA-CPP-SWCNT能够保护组装在其中siRNA免受核糖核酸酶降解,低毒性,穿过细胞膜并能够逃逸溶酶体,最后通过降解mTOR mRNA抑制mTOR的表达并促进肿瘤细胞的凋亡和死亡。