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胶质瘤是颅内最常见的肿瘤之一,具有易恶变,易复发的特点。目前临床上常见的治疗方式有手术治疗、放射治疗、化学治疗、免疫治疗,其中化疗与免疫治疗联合广受关注,然而由于血脑屏障及血脑肿瘤屏障的存在,化疗药物和免疫检查点阻断剂到达胶质瘤本身的数量非常有限。因此,胶质瘤治疗面临的挑战不仅包括化疗药物和免疫治疗药物的开发,而且还缺少一个强大的递送平台,充分结合化疗与免疫治疗联合治疗的优势。仿生纳米递送系统（BDDS）是一种新颖的生物递送策略,具有长循环、病位点靶向性和免疫逃逸等特性,其中细胞膜包裹的仿生纳米药物递送系统广泛用于抗癌治疗,包括提高癌症药物递送的有效性以及增强癌症疫苗的免疫原性。对于药物传递,这些纳米粒需要大量合成材料作为支架,往往导致载药量低,而且配体修饰的靶向给药系统容易破坏细胞膜表面的蛋白特性,影响靶向系统的稳定性。本研究以脑部疾病靶向治疗为出发点,旨在基于细胞膜融合技术,在不使用外源性免疫佐剂和修饰的配体的情况下,我们将胶质瘤细胞膜与树突细胞膜融合,构建出一种双膜融合载体。一方面,融合膜载体继承了肿瘤细胞同源靶向的特性,可以跨越血脑屏障将高浓度的化疗药物递送到肿瘤病灶部位,另一方面,融合膜携带了丰富且完整的肿瘤细胞膜抗原,基于树突细胞专业的抗原呈递特征,通过直接或间接的方式促进了细胞膜结合肿瘤抗原的摄取和下游的免疫应答。化疗与免疫治疗协同作用以期对脑部疾病靶向治疗起到推动作用。本课题主要通过仿生纳米载体的构建与表征,体内外安全性初步评价,肿瘤靶向性,免疫激活能力,胶质瘤抑制效果五部分内容展开研究。全文关键内容如下:（1）成功构建融合膜包裹的仿生纳米混悬液（DNS-[C6＆DC]m）,该仿生纳米混悬液具有良好的理化性质,为其体内外生物学评价奠定了基础。以多西他赛（DTX）为模型药,构建仿生纳米递送系统,主要分三部分展开:DTX纳米混悬液（DNS）的制备,双膜融合载体（[C6＆DC]m）的研究,仿生纳米混悬液（DNS-[C6＆DC]m）的制备。首先采用超声沉淀法制备DNS,以粒径,电位,稳定性为指标,采用单因素实验优选DNS的最佳处方,透射电镜下观察到该DNS粒径均一,较为圆整;通过X衍射,差示扫描量热分析法及红外光谱法验证了DNS的成功制备;接下来是[C6＆DC]m的研究,采用低渗法提取肿瘤细胞膜（C6m）,反复冻融法提取树突细胞膜（DCm）,为了验证肿瘤细胞膜不含肿瘤细胞核等相关遗传物质,通过激光共聚焦显微镜到提取的C6细胞膜与细胞核的分离;采用超声融合法进行细胞膜的融合,以荧光共振能量转移实验进行验证及细胞膜比例的筛选,共聚焦显微镜下可以观察到两种细胞膜的共定位信号,初步验证了两种类型的细胞膜融合并作为载体用于药物递送的可行性;最后采用挤出法制备膜仿生纳米混悬液,以粒径、电位、载药量、包封率为指标,对挤出工艺进行筛选,以蛋白浓度为指标对细胞膜与纳米粒比例进行筛选,最终确定挤出次数20次,膜药比为3:1;以最终处方工艺制备三批仿生纳米混悬液,进行理化性质表征,透射电镜下观察到我们制备的双膜融合仿生纳米混悬液具有明显的核壳结构,使用BCA试剂盒检测所有样品的蛋白质含量,发现制备过程导致的蛋白质损失较少,融合膜蛋白量为两种细胞膜蛋白的叠加。粒径结果显示包裹细胞膜使纳米粒厚度增加约为一层细胞膜的厚度,电位增强,有利于维持载体系统的稳定性;稳定性试验发现融合膜可以显著提高DNS的稳定性,这归因于基于细胞膜覆盖的屏蔽效应;SDS-PAGE及Western blot实验结果显示融合细胞膜中几乎可以检测到树突细胞膜和肿瘤细胞膜的所有蛋白,包括特定的同源结合粘附分子和免疫相关抗原,圆二色谱检测到蛋白质二级结构没有变化,为仿生纳米载体的功能的发挥奠定了有效的结构基础;体外释放结果表明细胞膜包裹后纳米混悬液的控释行为得到改善,推测进入体内可以延长药物的作用时间。（2）DNS-[C6＆DC]m在细胞水平和动物水平显示出良好的生物安全性在细胞水平和动物水平对仿生纳米载体的毒性进行了初步评价,在给药剂量下小鼠在组织学和血液生化方面未出现明显毒性,初步判定仿生纳米载体具有一定的安全性。（3）DNS-[C6＆DC]m可以有效促进树突细胞的成熟及T细胞的活化采用流试细胞术对仿生纳米递送系统的免疫激活能力进行了初步的体外评价,通过流式细胞实验结果可以看出,融合膜处理后的CD80+和CD86+树突细胞的百分率明显高于其他各组,说明融合膜载体携带了丰富的肿瘤抗原,基于其专业提呈功能,更容易被体内的树突细胞摄取成熟;在我们的免疫设计中,CD8+T细胞是杀死癌细胞的主要力量,CD4+T细胞可以帮助CD8+T细胞的增殖并增加其对肿瘤的毒性;为了评估T淋巴细胞的活化水平,与单膜处理组相比,融合膜组T细胞的增殖具有更强的促进作用;受体外免疫效果的鼓舞,接下来评估了体内注射融合膜纳米系统引起的抗肿瘤免疫反应。通过免疫荧光染色检测不同治疗方案下脾脏,淋巴结,肿瘤部位CD8和CD4因子的表达。同样发现了融合膜纳米载体依靠树突细胞膜的抗原呈递功能诱导机体的免疫应答。（4）DNS-[C6＆DC]m可以高效跨越血脑屏障屏障到达胶质瘤部位为了考察仿生纳米混悬液的脑靶向特性,分别从细胞、动物水平验证了仿生纳米载体系统的BBB及BBTB渗透性,首先构建体外血脑屏障及血脑肿瘤屏障模型,考察不同纳米混悬液的体外跨膜转运及抗肿瘤效果,结果显示双膜融合仿生纳米混悬液显示出较好的体外跨BBB及BBTB的能力,对神经胶质瘤细胞具有最高的抑制率;建立小鼠脑胶质瘤原位模型,采用活体成像考察仿生纳米载体体内脑靶向性,结果显示荷瘤小鼠的大脑中显示出良好的分布,随着时间延长,膜融合组脑内荧光增强趋势明显,说明仿生纳米载体的具有良好的脑靶向性及长循环特性。（5）DNS-[C6＆DC]m通过药物递送及激活免疫系统显示出较好的抗肿瘤效果从细胞及动物水平考察了双膜融合仿生纳米混悬液的抗肿瘤效果。细胞实验结果显示融合膜组增强了C6胶质瘤细胞的细胞毒性和细胞凋亡。动物水平药效学研究显示,双膜融合仿生纳米混悬液显著延长了胶质瘤小鼠的生存时间。核磁成像结果监测到胶质瘤生长明显受到抑制。小鼠组织病理切片可以看出融合膜纳米药物组的小鼠肿瘤细胞最生长最稀疏,出现的坏死区域最多;CD31及TUNEL染色均显示融合膜细胞凋亡最明显,在生理状态方面,仿生纳米混悬液治疗的小鼠无体重降低现象,这与仿生纳米混悬液增强DTX了的颅内胶质瘤靶向性和治疗效果,也改善DTX的副作用是一致的。综上所述,本课题在不引入外源性免疫佐剂和靶向配体的情况下,构建了一种多功能的仿生纳米递送系统,化疗与免疫治疗相结合,显著提高了胶质瘤的治疗效果,并且该系统载药量高,易于制备,具有临床转化的潜力。