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目的:牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）是一种内源性骨组织工程技术（Endogenous Bone Engineering）,因其手术操作过程较为简便且成骨迅速而广泛用于先天、后天骨量不足或大块骨缺损的修复与治疗。DO的新骨形成与血管新生紧密相关,血管的新生在时间和空间上先于新骨的形成,在牵张早期的组织内就已经开始出现大量的血管及增高的血流量,但DO快速血管新生的具体机制目前尚未完全阐明。在本课题组前期的序列研究中发现DO的血管新生与EPCs的动员、募集和分化有关。通过对DO新生组织进行miRNAs基因序列分析发现,固定0周和2周的组织内miR-21的表达与正常成年犬下颌骨、新生犬下颌骨均有显著的差异,呈明显增高趋势,而组织中的血管新生随着固定时间的延长,呈下降趋势。因此,我们推测miR-21与DO的血管新生存在着负相关的关系,但是两者之间的调控媒介并未全完明确。结合EPCs在血管新生中的促进作用,可以假设miR-21可能通过调控EPCs中的某一个基因或信号通路,实现调节DO血管新生的目的。本实验将通过体内、外实验探讨和验证miR-21对EPCs的调控作用,阐述DO血管新生的机制,补充DO血管迅速形成的生物学依据。方法:1.采用密度梯度离心法和差速贴壁法从成年犬骨髓血中分离和培养EPCs。用流式细胞术检测细胞表面的CD34和CD133抗原表达情况对EPCs进行验证。将所培养的EPCs接种于Matrigel上培养,观察小管形成情况,验证其形成血管的能力。2.构建miR-21 inhibition、miR-21 overexpression、miR-21无意义序列慢病毒载体、miR-21靶基因检测用相关质粒。通过双荧光素酶报告检测系统验证miR-21与TGFβ2的结合。摸索各病毒转染EPCs的感染复数（MOI）。体外实验组分为4组:EPCs组,空病毒对照组（Control组,转染miR-21无意义序列病毒）,miR-21抑制组（miR-21 inhibition组,转染miR-21 inhibition慢病毒）,miR-21过表达组（miR-21 overexpression组,转染miR-21 overexpression慢病毒）。细胞经过病毒感染48h后,更换嘌呤霉素筛选培养基继续培养24h,CCK-8法检测慢病毒感染对EPCs增殖能力的影响,Matrigel成管实验检测EPCs成管腔效果,免疫荧光法检测CD34、CD133、CD31、VEGF的表达,RT-q PCR检测miR-21、TGFβ2、SMAD2、SMAD3、SMAD7、CD34、CD133、CD31、VEGF、S100A4基因的表达情况,WB检测SMAD2、SMAD3、CD34、CD133、CD31、VEGF、S100A4蛋白的表达情况。3.构建犬下颌骨DO动物模型,将实验动物分为6组:DO组（牵张间隙无处理）,Matrigel组（牵张间隙注射Matrigel）,EPCs组（牵张间隙内注射EPCs-Matrigel混合物）,Cotrol组（牵张间隙注射转染空病毒载体的EPCs-Matrigel混合物）,miR-21 inhibition组（牵张间隙注射转染了miR-21inhibition慢病毒的EPCs-Matrigel混合物）,miR-21 overexpression组（牵张间隙注射转染了miR-21 overexpression慢病毒的EPCs-Matrigel混合物）。每组实验动物在牵张第4天往牵张间隙内注射不同的物质,分别于固定期7天,14天收集样本。对样本进行大体观察和X线检查,并取出牵张间隙内的新生组织进行HE染色、Masson染色和免疫组化染色检测分析CD31、VEGF、S100A4、CD133、SMAD3蛋白的表达。结果:1.EPCs原代培养时呈集落式生长,在培养皿上分布不均匀。集落中的细胞由于生长空间的限制,细胞可呈短椭圆形、长梭形等形态。但是经过消化、重悬后,细胞生长空间比较均匀一致,传代细胞基本呈典型“铺路石”或“鹅卵石”状。流式细胞术结果显示EPCs高表达CD34和CD133表面标记,且其在Matrigel上培养12h后,可形成管腔样结构。这些结果均证实本实验所分离培养的细胞是EPCs,可用于后续的实验操作。2.双荧光素酶检测实验结果证实miR-21与TGFβ2的3’UTR能结合,并且能抑制EPCs中TGFβ2的表达。空病毒、miR-21 inhibition和miR-21 overexpression病毒感染EPCs的最佳MOI为20。CCK-8结果显示,EPCs组,Control组,miR-21 inhibition和miR-21 overexpression组的细胞培养24h后,数量均有所增加,但各组间数量无显著差异,说明慢病毒转染和miR-21表达的变化并不会影响EPCs的增殖活力。Matrigel成管实验显示miR-21 inhibition组中的节点、交叉点、网眼数、网眼面积均比其他三组显著增高,而miR-21 overexpression组则较其它三组显著降低,EPCs组和Control组无显著区别,表明抑制miR-21的表达会引起EPCs成管能力的增强,而miR-21的过表达会导致EPCs成管能力的减弱。免疫荧光染色结果显示,各组的细胞基本都表达CD34,部分细胞表达CD133,但是各组间无显著差异。miR-21 inhibition组CD31、VEGF表达强于其它三组,而miR-21 overexpression组则弱于其它组别,EPCs组和Control组组间无差别,表达水平介于前两者之间。RT-q PCR结果显示,转染miR-21 inhibition慢病毒后,miR-21的表达量明显下降,而转染miR-21 overexpression慢病毒后,miR-21的表达量明显提高,转染空病毒的Control组细胞和未经处理的EPCs组细胞miR-21的表达量无明显差别,说明转染体系稳定,能有效控制miR-21的表达。miR-21与TGFβ2、SMAD2、SMAD3的表达趋势呈负相关,而与SMAD7呈正相关。EPCs的细胞表型即CD34和CD133表达的情况在各实验组之间并无明显差异。但血管生成的阳性指标CD31、VEGF、S100A4在miR-21 inhibition组均明显增高,而在miR-21 overexpression组则显著下降。EPCs组和Control组组间无差别,表达介于前两者之间。WB检测结果显示SMAD2、SMAD3、CD34、CD133、CD31、VEGF、S100A4蛋白的表达与RT-q PCR相应基因的表达趋势一致。3.大体观察发现各组牵张间隙内的新生组织呈红白色,略有弹性,各组间的样本并无显著区别。X线片检查可见牵张间隙为低密度影像,未见确切的骨形成影像,各组间并无显著差别。HE结果显示:固定7天时,各组内均可见丰富的血管成分,但miR21-inhibition组中血管成分较其它组少,且开始出现软骨岛。固定14天时,DO组、Matrigel组、EPCs组、Control组和miR-21 inhibition组在毛细血管、纤维、细胞组成的粉红色基质中出现了较多的骨小梁,而miR-21overexpression组仍可见丰富的血管成分,偶可见少量的软骨样结构,并未见到骨小梁结构形成。提示miR-21 inhibition组血管化过程缩短,提前进入骨化阶段。miR-21 overexpression组血管化过程延长,骨化时间滞后。根据Masson结果得出各组胶原数量由高到低的顺序为:miR-21 inhibition组>EPCs组、Control组>DO组、Matrigel组>miR-21 overexpression组。根据CD31、VEGF、S100A4阳性染色结果得出各组血管化程度由高到低的顺序为:miR-21 overexpression组>DO组、Matrigel组>EPCs组、Control组>miR-21 inhibition组。固定7天和固定14天时,各组CD133染色均较弱,各组间无显著差别。SMAD3染色结果显示,SMAD3主要分布在血管及其周围的细胞内,固定7天时,表达趋势与血管形成相关指标CD31、VEGF、S100A4相似;但是在固定14天时,除在miR-21 overexpression组表达稍高外,其它各组表达均较弱,尤其是miR-21 inhibition组。结论:1.EPCs可于体外迅速分化为内皮细胞,表现出较强的成血管能力,并在DO动物模型中加速新生组织内的血管新生。2.MiR-21与血管生成呈负相关,miR-21的过表达会导致EPCs体外血管生成能力下降,使得DO新生组织的血管化滞后;而抑制miR-21会出现相反的结果,表现为血管生成速度加快。3.MiR-21在EPCs中可直接与TGFβ2基因结合,抑制TGF-β/Smad信号通路的激活,提示miR-21可能通过调节TGFβ/Smad控制EPCs成血管的功能。