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尽管体细胞核移植(SCNT)技术已在多种动物上获得克隆后代,但克隆技术仍存在许多问题,有待进一步研究完善。DNA甲基化是哺乳动物表观遗传修饰基因调控表达的主要形式之一,供体核去甲基化不彻底或克隆胚胎过早发生重新甲基化,有可能影响克隆胚胎的正常发育。DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azaC),是一种胞嘧啶类似物,能与胞嘧啶竞争性结合于DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferase, DNMT)上,通过降低酶的活性来影响基因的表达。本试验主要以猪SCNT胚、体外受精(IVF)胚和孤雌激活胚为研究对象,通过不同方式、不同浓度5-azaC的添加,观察其对供体细胞、SCNT胚、IVF胚及孤雌激活胚发育的影响。结果如下：1、5-氮杂胞苷对核供体细胞的影响以猪卵丘细胞为核供体细胞,在体外培养的卵丘细胞中添加5-azaC,以期通过改变供体细胞的DNA甲基化水平来提高其后在受体胞质中的重编程能力,为提高猪克隆胚体外生产效率探索一条新途径。但是5-azaC对细胞具有一定的毒害作用,且对体外培养的细胞尤为敏感。因此选择合适的作用浓度与作用时间尤为重要。本试验分别选用0、0.01、0.05、0.1和1μM5-azaC处理卵丘细胞72h,通过光学显微镜观察其对卵丘细胞的形态学影响,通过制作生长曲线研究其对卵丘细胞增殖分裂的影响,并通过彗星试验检测其对细胞凋亡的影响。结果发现,1μM以下的低浓度组对细胞的形态以及生长情况无明显影响,而1μM的高剂量组则改变了体外培养的卵丘细胞形态,抑制了细胞的分裂增殖,并且明显增加了凋亡细胞的数目。该结果表明在用5-azaC处理卵丘细胞72h时,应以1μM以下的作用浓度为宜,而使用1μM及以上作用浓度时,其毒性作用可能会使细胞产生明显的变化。2、5-氮杂胞苷对猪体外生产胚胎的影响以猪SCNT胚、IVF胚及孤雌激活胚为研究对象,将5-azaC以不同的作用方式进行处理,研究其对猪不同类型体外生产胚胎体外发育的影响。通过对本实验过程中猪卵母细胞体外成熟、去核效果与重构胚发育情况进行评价,结果发现卵母细胞的体外成熟率可达76.9%,去核率为82.9%。FDA染色检查发现,重构胚存活率可达84.8%,而对4-细胞和8-细胞期克隆胚胎的FDA染色表明,其存活率均为100%。将5-azaC处理72h的卵丘细胞用作核供体经核移植后,观察SCNT胚胎的发育情况。结果发现,与对照组相比,0.01μM组的SCNT胚卵裂率(73.8%对67.1%)略高,但统计学差异不显著；而1μM浓度组的克隆胚后期发育效果明显下降。在早期SCNT胚胎培养液中分别添加0、0.1、1和10μM5-azaC处理48h后发现,与对照组相比,1μM浓度组SCNT胚的卵裂率(71.7%对66.7%),8-细胞发育率(47.8%对44.4%)略高,但差异均不显著(P>0.05)；而10μM5-azaC浓度组胚胎的卵裂率(43.2%对66.7%)、桑椹胚发育率(4.5%对17.8%)均显著下降(P<0.05)。在早期IVF胚培养液中分别添加0、0.1、1和10μM5-azaC处理48h或60h,与对照组相比发现,1μM5-azaC处理48h能明显提高ⅣF胚胎卵裂率(80.0%对60.3%,P<0.05),但桑椹胚发育率未获明显提高(25.0%对23.1%,P>0.05),而10μM浓度组不论是处理48h还是60h,均降低了IVF的后期发育效果。在早期孤雌激活胚培养液中分别添加0、0.1、1和10μM5-azaC处理48h或60h,结果与对照组相比,1μM处理48h和60h均能显著提高其卵裂率(分别为81.8%对62.9%和83.3%对63.3%；P<0.05),但桑椹胚发育率均未获明显提高(30.3%对24.3和29.2%对24.5%；P>0.05),同样10μM5-azaC浓度组降低了胚胎的卵裂率,8-细胞以及桑椹胚发育率。比较同浓度内5-azaC作用不同时间对ⅣF胚及孤雌激活胚的影响,只筛选出对ⅣF胚以及孤雌激活胚发育较好的0.1μM与1μM两组进行比较,结果发现在同浓度内5-azaC作用48h和60h,胚胎的卵裂率,桑椹胚发育率均无明显差异(P>0.05)。由以上结果可以看出,不同浓度的5-azaC作用于卵丘细胞72h或早期SCNT胚48h,均未能提高SCNT胚胎的发育能力,而IVF及孤雌激活胚通过早期培养液添加5-azaC可提高其卵裂率,但桑椹胚发育率也无明显提高,高浓度5-azaC处理均降低了猪SCNT、IVF及孤雌激活胚的发育能力。