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本试验就临床分离的猪链球菌进行体外生物被膜构建,采用结晶紫染色法、银染法、扫描电子显微镜、激光共聚焦显微镜对构建的生物被膜进行形态学鉴定和半定量测定；同时研究了影响猪链球菌生物被膜形成的体外因素和常用抗菌药物对生物被膜形成的影响,为临床用药提供一定的参考,并为进一步研究猪链球菌生物被膜耐药机理奠定基础。具体研究内容如下。采用微量板培养,结晶紫染色法测定临床分离的两株猪链球菌在聚苯乙烯表面上生物被膜形成的能力。结果显示：猪链球菌临床分离的2型菌株YY060816和9型菌株NJ-3培养1天后,通过结晶紫染色经酶标仪测定OD550值,与浮游菌(CK)OD550值比较,差异极显著(P<0.01),表明猪链球菌菌株YY060816和NJ-3能够在酶标板的底部粘附形成生物被膜。通过银染法快速鉴定了体外构建的两株临床分离猪链球菌的生物被膜。结果显示：空白和浮游菌NJ-3的玻璃盖玻片经过银染后,经显微镜检查,其上无颗粒,染色均匀,无浓密、黑染交织分布的物质出现,而猪链球菌NJ-3和YY060816菌株培养2天后,玻璃盖玻片上有浓密黑染交织分布的物质,其间隙聚集着猪链球菌菌体,形成了猪链球菌生物被膜。进一步佐证猪链球菌生物被膜在体外构建成功通过扫描电镜对体外构建的两株临床分离猪链球菌生物被膜进行鉴定。结果显示：偏氟酸有机滤膜表面粗糙,有较为明显的空洞。这种结构有利于生物被膜的形成；猪链球菌YY060816浮游菌菌体均匀,呈球状,表面较为光滑,聚集在一起,其间无分泌物；猪链球菌YY060816菌株培养1天生物被膜显示(×6000倍),偏氟酸有机滤膜表面结构有很大的变化,滤膜表面覆以粘稠样物质,且粘稠样物质内包裹有多层菌体。12000倍时的猪链球菌YY060816生物被膜扫描电镜图片可见粘稠样物质和菌体更为清晰,部分粘稠样物质下覆有多层菌株；猪链球菌NJ-3菌株生物被膜扫描电镜图片(×6000倍),可见粘稠样物质较YY060816菌株更厚,被覆多层菌体。采用异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白A (FITC-ConA)和碘化丙啶(PI)两种荧光染料对玻璃盖玻片上培养的猪链球菌NJ-3生物被膜进行染色,使用激光共聚焦显微镜(CLSM)进行观察。结果显示：经灭菌处理的空白盖玻片未被染成绿色和红色,说明盖玻片未被细菌和多糖污染可以作为载体；培养12h的猪链球菌NJ-3浮游菌经FITC-ConA染色,没有绿色荧光物质,而菌体被PI染成红色,说明培养12h的NJ-3浮游菌不分泌多糖；生物被膜组经FITC-ConA染色有绿色荧光物质出现,而且绿色荧光物质将染成红色的猪链球菌包裹,并且培养3天的猪链球菌所形成的生物被膜较较1天的绿色荧光物质密度高,说明在盖玻片上培养1天即能形成生物被膜,随着培养时间的延长,生物被膜的形成逐渐增加。采用结晶紫染色法研究了培养基中葡萄糖和氯化钠浓度对猪链球菌NJ-3和98012菌株粘附性的影响,并对临床分离的46株猪链球菌生物被膜形成能力进行分析。结果显示：随着培养基中葡萄糖浓度的增加,猪链球菌NJ-3和98012菌株在微孔板上的粘附性增强；培养基中NaCl浓度为0.5%时,两株猪链球菌的粘附性最强,随着NaCl浓度的继续增大,粘附性减弱；不同猪链球菌临床分离菌株具有不同的生物被膜形成能力,在46株猪链球菌中,9型菌株形成生物被膜的能力较强,在28株2型的猪链球菌菌株中,OD550值大于0.1的有3株(10.7%),小于0.1的有25株(89.3%),而16株9型的猪链球菌中,OD550值大于0.1的有13株(81.3%),小于0.1的有3株(18.7%)。1株1型和1株7型菌株的OD550值均小于0.1。采用结晶紫染色法研究了6种抗菌药物对猪链球菌生物被膜形成的抑制作用。结果显示：青霉素、红霉素、阿奇霉素、环丙沙星、氧氟沙星、大蒜素六种抗菌药物在亚抑菌浓度下即能抑制猪链球菌生物被膜的形成,且随着药物浓度的增加,抑制生物被膜形成的作用会逐渐增强。6种抗菌药物中,环丙沙星和氧氟沙星抑制猪链球菌生物被膜形成的作用优于其他4种抗菌药物。