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背景及目的:原发性肝癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,根据2020年全球癌症统计数据,全球每年有90多万新发肝癌病例患者,占全球新发肿瘤的4.7%,并且约80万人死于肝癌,占全球肿瘤死亡人数的8.3%,是全球第六大常见癌症和第三大癌症死亡原因。尽管早期肝癌接受系统治疗后5年生存率可达70%,但有研究表明大部分患者在出现症状就诊时已是晚期,肿瘤已经发生血管侵犯、肝内多发转移、肺转移等转移,导致失去根治性手术治疗的机会,其中位生存期仅为1至1.5年。因此,了解与研究肝癌侵袭转移的分子机制,对于寻找新的肝癌分子治疗靶点具有重要意义。人泛素特异性蛋白酶7（USP7）,又被称为疱疹病毒相关蛋白酶（HAUSP）,是一种半胱氨酸肽酶,作为泛素蛋白酶体系统（UPS）中的去泛素化酶（Dubs）,USP7可以将泛素从底物上移除,降低底物的泛素化水平,从而避免底物被降解,稳定底物的蛋白水平,进而调节多种细胞进程,包括DNA损伤反应、免疫反应、细胞转录、表观遗传和病毒感染。研究发现USP7在多种恶性肿瘤中都发挥了重要的作用,然而,关于USP7对肝癌侵袭迁移能力的影响及其具体调控机制仍不清楚。本研究拟通过以下内容研究USP7影响肝癌侵袭迁移的具体调控机制:验证USP7在肝癌中的表达情况并分析USP7表达与肝癌患者生存预后间的关系;验证USP7对肝癌细胞的侵袭迁移能力的影响;探讨USP7影响肝癌侵袭迁移的具体调控机制。方法:1.分析CPTAC数据库中USP7在肝癌及癌旁组织的蛋白表达情况,Western blot及免疫组化检测肝癌组织与癌旁组织中USP7蛋白表达量;并探讨USP7高表达组与低表达组间生存预后间的差异。2.通过实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR q RT-PCR）及Western blot检测正常人肝细胞HL-7702及肝癌细胞系Huh-7、Hep3B、MHCC97H、SMCC7721、HCCLM3中USP7的m RNA表达水平;选择USP7表达量较高的肝癌细胞株HCCLM3用于稳定转染sh USP7干扰质粒,选择USP7表达量较低的肝癌细胞株MHCC97H用于稳定转染USP7过表达质粒。构建好稳转细胞系后,利用Western blot验证干扰及过表达效果,Transwell及细胞划痕实验验证改变肝癌细胞中USP7表达对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响,同时构建裸鼠尾静脉注射瘤模型,观察肝癌细胞体内转移能力的变化。3.通过蛋白质谱检测干扰USP7表达后发生表达变化的下游蛋白,并通过Western blot进行验证USP7对下游蛋白的调控作用,并通过Western blot及连续切片免疫组化在肝癌组织中验证USP7与靶蛋白的表达关系。同时通过回复实验验证USP7影响肝癌侵袭迁移的关键分子是否为该靶蛋白。4.通过激光共聚焦实验及免疫共沉淀技术验证USP7与靶蛋白的结合情况,通过加入蛋白酶体抑制剂MG132观察靶蛋白的表达随时间的推移而发生的变化,并且通过加入CHX的同时改变USP7的表达,观察下游靶蛋白表达发生的变化,明确USP7是否通过泛素-蛋白酶体系统影响靶蛋白的降解。并且通过改变USP7的表达后,观察下游靶蛋白与USP7结合量及泛素化水平是否发生变化,明确USP7是否通过泛素蛋白酶体影响靶蛋白的表达。通过加入USP7抑制剂P5091干扰其去泛素化功能,观察靶蛋白表达变化及肝癌侵袭迁移能力的变化,以明确USP7发挥去泛素化酶功能稳定靶蛋白进而影响肝癌细胞侵袭转移。结果:1.通过分析CPTAC数据库,我们发现肝癌组织中USP7的蛋白表达水平要显著高于癌旁组织,通过免疫组化及Western blot证实USP7的蛋白水平在肝癌组织中显著高于癌旁。将收集的60例肝癌数据分为USP7高表达组与USP7低表达组进行生存分析,Kaplan-Meier结果显示,USP7低表达的肝癌患者总生存率显著高于USP7高表达的肝癌患者（P＜0.05）。2.通过q RT-PCR及Western blot检测正常人肝细胞HL-7702及肝癌细胞系Huh-7、Hep3B、MHCC97H、SMCC7721、HCCLM3中USP7的m RNA表达水平,利用HCCLM3细胞株构建USP7稳转干扰细胞系,利用MHCC97H构建USP7稳转过表达细胞系。Western blot检测HCCLM3细胞中干扰USP7后表达显著降低,而MHCC97H细胞株中过表达USP7后表达显著升高。利用Transwell及细胞划痕实验证实在HCCLM3中干扰USP7后,细胞侵袭迁移能力下降,而在MHCC97H中过表达USP7后,细胞侵袭迁移能力升高（P＜0.05）。体内实验同样证实,干扰USP7的表达后,裸鼠尾静脉注射模型发生肺转移的结节数量减少,而过表达USP7后,裸鼠尾静脉注射模型发生肺转移的结节数量增多,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.通过差异蛋白质谱,我们发现改变USP7的表达后,OGT表达同样发生改变,通过Western blot验证改变USP7的表达后OGT/O-GlcNAc的表达变化,结果发现USP7与OGT表达呈正相关。并通过Western blot及连续切片免疫组化在肝癌组织中验证USP7、OGT及O-GlcNAc的表达关系,我们发现在高表达USP7的肝癌组织标本中,OGT及O-GlcNAc同样呈高表达。进一步我们通过Transwell及细胞划痕实验发现,在干扰USP7的HCCLM3细胞中同时过表达OGT,细胞由于干扰USP7导致的侵袭迁移能力下降得到了部分回复,而在过表达USP7的MHCC97H细胞中同时干扰USP7表达后,细胞由于过表达USP7导致的侵袭迁移能力增强也得到了部分回复,表明OGT是USP7调控肝癌侵袭迁移的关键分子。4.通过q RT-PCR、Western blot及免疫共沉淀技术证实USP7调控OGT蛋白水平而不影响其m RNA水平,并且USP7与OGT蛋白直接结合,并通过加入蛋白酶体抑制剂MG132发现,OGT的表达随时间的推移而表达逐渐降低,而加入MG132的同时改变USP7的表达,发现上调和下调USP7的蛋白表达均对OGT蛋白表达无影响,其次,在加入蛋白合成抑制剂放线菌酮CHX时,过表达USP7可使OGT的降解减慢,而干扰USP7后OGT的降解加快,表明USP7可通过泛素-蛋白酶体系统影响靶蛋白的降解。在HCCLM3以及MHCC97H中改变USP7的表达同时添加蛋白酶体抑制剂MG132处理,结果发现,USP7表达下调后,OGT与USP7结合减少,而OGT泛素化水平升高,USP7过表达后,OGT与USP7结合增多,而OGT泛素化水平降低,表明USP7通过抑制OGT的泛素化降解稳定OGT的蛋白表达。最后,我们通过在肝癌细胞HCCLM3中,加入USP7抑制剂P5091,观察OGT及O-GlcNAc蛋白表达改变以及OGT泛素化水平的改变,结果发现,P5091处理后,OGT及O-GlcNAc表达降低,并且OGT泛素化水平升高。并分别通过体内外实验验证肝癌细胞株侵袭迁移能力的改变,结果发现,在HCCLM3细胞中添加P5091后,肝癌的侵袭迁移能力显著下降,P5091治疗组的裸鼠肺转移结节数量明显减少。以上结果表明USP7发挥去泛素化酶功能稳定OGT蛋白进而上调O-GlcNAc并促进肝癌细胞侵袭迁移。结论:USP7在肝癌组织中高表达,USP7高表达与肝癌不良生存预后密切相关。过表达USP7通过抑制OGT泛素化稳定其表达,进而上调O-GlcNAc并促进肝癌细胞侵袭迁移。