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由于气候变化、社会经济的高速发展以及人类不合理地灌溉耕作等导致了土壤盐渍化及次生盐渍化的日趋加重,从而使得植物的生长发育受到了越来越大的威胁。高盐胁迫会给植物带来众多危害,主要包括生理干旱、离子毒害、生理代谢紊乱等,从而严重影响农作物的产量。对于大部分的植物来说,高盐胁迫给植物带来的危害主要是由于高浓度的 Na+的积累所导致的。尽管不同植物的耐盐机制存在一定的差异,但是其基本的策略都是保持胞内 Na+的平衡。众多研究表明,Na+/H+逆向转运蛋白可以通过介导 Na+的转运来减轻高盐胁迫对植物的危害。目前已经从多种植物中克隆到了编码Na+/H+逆向转运蛋白的基因,而且通过研究发现将这些基因过量表达到其他植物体内可以提高转基因植株的耐盐性,对于解决土壤盐渍化问题具有非常重要的作用。 互花米草(Spartina alterniflora)是一种高度耐盐的盐生植物,它主要生活在沿海滩涂的潮间带,且具有很好的耐淹、抗风浪的能力。这些特点使得互花米草成为研究植物耐盐机制材料的很好选择。 本实验采用盐生植物互花米草为实验材料,克隆并分析了编码Na+/H+逆向转运蛋白的 SaNHX1、SaNHX2和 SaNHX3基因在胁迫条件下的表达变化。并且构建了植物过量表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥和水稻,并对获得的纯合转基因拟南芥株系进行了耐盐性分析。具体实验结果如下: (1)基因的克隆及序列分析 根据本实验室互花米草转录组测序中得到的部分片段信息设计特异性引物,并利用RACE技术克隆得到了三个编码Na+/H+逆向转运蛋白的基因全长序列,分别命名为SaNHX1、SaNHX2和SaNHX3。其中SaNHX1 cDNA全长为2277 bp,编码540个氨基酸残基;SaNHX2 cDNA全长为2091 bp,编码539个氨基酸残基;SaNHX3 cDNA全长为1985 bp,编码522个氨基酸残基。经比对发现这三个基因与水稻、玉米、小麦等的NHX基因亲缘关系较近。 (2)基因表达量的变化 分别用600 mmol/L NaCl溶液和100μmol/L ABA溶液对互花米草幼苗进行浇灌和喷洒,处理时间分别为0h(对照)、3h、6h、12h、24h,结果显示,SaNHX1、SaNHX2和SaNHX3这三个基因的表达量都随着胁迫处理时间的延长发生了相应的变化,因此推测这三个基因在互花米草抗逆机制中可能发挥着重要作用。 (3)基因的异源表达研究 对筛选得到的纯合转基因拟南芥株系进行实时荧光定量PCR检测,分析不同转基因株系中外源基因表达量的差异。最终选取相对表达量较高的两个株系进行种子萌发、根长测量以及相应的生理生化指标的测定。实验结果显示,在相同的盐处理条件下,转基因拟南芥的萌发情况,根长生长情况都要明显优于野生型。并且鲜重、叶绿素、电导率、MDA、Na+、K+含量等指标也都证实了转基因拟南芥的生长优势。这充分说明这三个基因的过量表达对于提高拟南芥植株的耐盐性具有重要的作用。 此外,对筛选得到的T2代水稻株系进行了扩繁,以期望得到纯合株系,并对其进行生理生化指标的测定。