背景:以脑卒中、冠状动脉粥样硬化性心脏病为代表的心脑血管疾病是全球第一大死亡原因,心脑血管疾病约占全球死亡原因的30%。动脉粥样硬化是一种慢性、炎症性疾病,也是心脑血管疾病的主要病理基础。动脉粥样硬化性心脑血管疾病负担重,其早治疗、早诊断具有重要意义。动脉粥样硬化发生的病理机制十分复杂,目前有众多假说。既往临床研究表明,高血脂是动脉粥样硬化发生和进展的重要危险因素。慢性炎症反应也是动脉粥样硬化的潜在机制之一,并且已有一些临床研究将炎性因子作为治疗靶点以评价其有效性和安全性。除此之外,高龄也是动脉粥样硬化发生和进展的危险因素。然而,炎症反应在早期动脉粥样硬化中的机制仍未阐明,高脂、高龄等高危因素在早期动脉粥样硬化中对免疫细胞的影响仍未阐明,并且目前尚无针对早期动脉粥样硬化的诊断标志物及治疗靶点。单细胞转录组测序是一种新兴的高通量测序技术,能够对数以万计的单个细胞的基因表达水平进行同时地、无偏倚地检测,从而能够帮助识别那些在病理环境下罕见的却又重要的细胞类型。既往有研究使用单细胞转录组测序对动脉粥样硬化斑块内的血管细胞和免疫细胞进行了分析,揭示了与动脉粥样硬化或脑血管事件有关的特殊巨噬细胞、平滑肌细胞和CD4+T细胞。然而,对动脉粥样硬化时外周血各种免疫细胞的转录水平改变的研究较少。通过对动脉粥样硬化时外周血免疫细胞进行单细胞水平转录组分析,能够揭示动脉粥样硬化时与免疫细胞募集、浸润有关的特殊细胞类型,从而为早期和进展期动脉粥样硬化的防治提供潜在的靶标。除此之外,通过比较动脉粥样硬化时和高龄相关动脉粥样硬化时外周血单个核细胞和颗粒细胞的转录组学改变,能够揭示高龄和动脉粥样硬化的共同机制。目的:1.探究早期动脉粥样硬化外周血免疫细胞转录组异质性及其与动脉粥样硬化的关系。2.探究早期动脉粥样硬化外周血淋巴细胞免疫组库特征及其与动脉粥样硬化的可能联系。3.探究早期动脉粥样硬化外周血免疫细胞之间的相互作用。4.探究与动脉粥样硬化相关的重要免疫细胞亚型和关键基因,为早期动脉粥样硬化提供潜在诊断标志物或干预靶点。方法:将实验动物分为5组,分别为:正常组,高龄正常饮食组,高龄高脂饮食组,Apoe-/-正常饮食组,Apoe-/-高脂饮食组。尾静脉取血并分离外周血单个核细胞及颗粒细胞,制备成单细胞悬液。应用5’端单细胞转录组及免疫组库测序的方法对大鼠外周血免疫细胞进行文库构建,在Illumina NovaSeq 6000平台进行测序。使用Cell Ranger对原始数据进行处理,使用R软件（版本4.0.3）对单细胞测序数据进行分析。分析公共动脉粥样硬化斑块免疫细胞的单细胞转录组测序数据,验证及探索动脉粥样硬化早期外周血免疫细胞的特征及差异基因在斑块中的表达水平。通过孟德尔随机化分析遗传预测地血液CSF1水平与动脉粥样硬化性心脑血管疾病的因果关系。结果:1.经质控后,最终对5组大鼠的共69,134个外周血免疫细胞进行了单细胞测序数据分析,其中单核细胞数量占比最高。通过动脉粥样硬化相关基因集打分分析,提示在中性粒细胞中,与动脉粥样硬化相关的基因相对高表达。2.对中性粒细胞进行亚组分析,发现一类中性粒细胞高表达Stfa2,且该类中性粒细胞在野生型大鼠中显著富集。进一步对普通的中性粒细胞进行亚组分析,通过差异分析提示相比于幼稚中性粒细胞,成熟中性粒细胞高表达与泡沫细胞分化等生物过程有关的基因。3.对单核细胞进行亚组分析及精确注释,发现一类经典单核细胞高表达S100a8,并且高表达与氧化磷酸化、解毒作用等功能相关的基因,基因集富集分析提示S100a8hi经典单核细胞中,流体剪切力和动脉粥样硬化有关的基因富集。4.CD4+T细胞可分为10个亚群,CD8+T细胞可分为6个亚群,其中CD8+效应记忆T细胞在高龄组中比例较高,基因集富集分析提示该亚群与动脉粥样硬化相关的通路富集。免疫组库分析提示该亚群存在显著克隆扩增。5.细胞间配体-受体通讯分析提示在高龄、高脂因素下,细胞间相互作用明显增多。其中CSF信号通路是以成熟中性粒细胞为配体、单核细胞为受体的特异信号通路,且CSF信号通路在高龄、高脂时预测上调。6.通过整合公共动脉粥样硬化斑块单细胞测序数据验证斑块中的中性粒细胞Csf1以及CD8+T细胞Gzmk表达。7.孟德尔随机化分析提示遗传预测地血液CSF1水平与冠状动脉粥样硬化性心脏病和心肌梗死的风险存在因果关系。结论:1.本研究通过单细胞转录组和免疫组库分析,提示了早期动脉粥样硬化外周血免疫细胞基因表达的异质性改变,特别是中性粒细胞和单核细胞,一些亚群可能通过泡沫细胞形成、氧化磷酸化参与动脉粥样硬化。2.高龄组大鼠外周血CD8+T淋巴细胞亚群存在克隆扩增,可能通过黏附、趋化作用参与动脉粥样硬化。3.成熟中性粒细胞-单核细胞CSF信号通路可能与早期动脉粥样硬化有关。