研究背景：鼻咽癌是我国南方高发的一种恶性肿瘤,特别是在广东地区。目前鼻咽癌确切的发病原因尚未研究清楚,大量的研究结果显示遗传因素、EB病毒感染、环境因素及饮食因素等与其密切相关。鼻咽癌多发于男性,高发于40-50岁患者。随着影像水平的迅猛发展和放射治疗水平的不断提高,鼻咽癌早期患者5年生存率高达70%以上。但是大部分鼻咽癌早期发病无明显的特异性,也缺乏有效的早期诊断指标,大部分就诊时已发展至晚期,大多伴有颈部淋巴结的转移甚至远处转移。这无疑大大降低了鼻咽癌的临床治愈率,生存率及生存质量也急剧降低。EB病毒已研究证实与鼻咽癌的发生息息相关,各种针对EB病毒的特异性抗原和抗体的检测是目前临床早期诊断和筛查鼻咽癌的主要手段,常用的VCA-IgA及EA-IgA检测,但灵敏度和特异性都不高,这不仅可能使早期肿瘤漏网,也给非肿瘤患者增加精神负担。关于鼻咽癌的早期诊断指标的探寻和确定,是相关研究者的重要任务。随着分子生物学的迅猛发展,肿瘤相关分子标记物的检测给肿瘤的早期诊断、疗效评估及预后随访开启了新的篇章。肿瘤患者外周循环游离核酸分子的检测是医学工作者关注的热点。在正常人和肿瘤患者的外周血液中均存在各种各样的游离核酸,与肿瘤相关的的特异性核酸的检测对于肿瘤患者的诊断和治疗有着重要的价值。端粒是近年来生命科学研究的热点,端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生发展密切相关。端粒酶是-种自身携带模板的逆转录酶,它在细胞中负责延长端粒,而端粒长度是决定细胞增殖能力和寿命的分子标志。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的亚单位,能以端粒自身所携带的RNA为模板合成端粒DNA,并加到染色体末端以延长端粒维持染色体的稳定进而延长细胞的寿命甚至可促使细胞永生化。hTERT只能在具有端粒酶活性的细胞中检测到,包括胚胎干细胞、生殖细胞、活化的淋巴细胞及绝大多数肿瘤细胞,其表达水平与端粒酶的活性呈正相关。已有大量研究证实,端粒酶及其亚单位在鼻咽癌及绝大多数恶性肿瘤中高表达,而在正常人体细胞中为阴性表达。近期人们在血浆端粒酶hTERT mRNA方面做了许多的工作,血浆hTERT mRNA有望成为肿瘤早期诊断、疗效评估和预后判断的一个新的分子生物学指标。循环肿瘤细胞近年来日益成为研究的热点。关于循环肿瘤细胞的大量报道已证实,循环肿瘤细胞和肿瘤的诊断及复发转移相关,同时实时监测疗程中肿瘤循环肿瘤细胞的变化,有助于及时评价治疗效果,随时调整治疗方案。因此,深入了解循环肿瘤细胞对于肿瘤的诊断、治疗及预后均具有重要的意义。国内外已有大量研究报道以肿瘤特异性分子标记物为载体,用实时定量PCR方法检测研究肿瘤患者外周血微量肿瘤细胞,已经应用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌等微转移的研究。综上：外周循环肿瘤细胞及血浆中肿瘤特异性RNA在肿瘤研究中均具有重要的价值。联合检测外周血肿瘤细胞及游离RNA用于肿瘤的诊断及治疗目前也尚未有报道。我们将用前瞻性的研究方法,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Q-PCR)检测鼻咽癌患者外周血循环肿瘤细胞及外周游离血浆中hTERT mRNA的表达水平,来了解其在鼻咽癌诊断及治疗中的临床应用价值。目的：利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Q-PCR)技术定量检测鼻咽癌患者外周血浆及循环肿瘤细胞中人端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT) mRNA的表达,研究其其表达与患者的性别、年龄及肿瘤瘤的临床分期、大小及淋巴结浸润范围等临床病理因素的关系,并探讨其在鼻咽癌中的诊断及治疗中意义,并将两者进行相关性分析,进一步探讨血浆中hTERT mRNA的来源。方法：1血浆中hTERT mRNA:33例鼻咽癌患者均来自南方医科大学珠江医院耳鼻喉科,治疗前所有患者按常规进行胸部正侧位片、腹部B超、头颈部增强CT、 MRI、全身骨扫描(SPECT)确定肿瘤的侵犯的范围和临床分期。入组标准：既往未接受过放射治疗者；无远处转移；疗程中断不超过5天；患者签署化疗及放疗同意书；病理为鼻咽低分化鳞癌；不伴有第二原发癌；年龄<75岁；卡氏评分>70。排除标准：放疗后复发再治疗；未完成治疗者；合并其他内科严重疾患(脑中风、糖尿病、高血压、心脏病等)；病理为非低分化鳞癌存在系统性疾病；发生远处转移；妊娠或哺乳期妇女；严重骨髓功能障碍者,任何其他状况为放化疗禁忌症者。按鼻咽癌2008临床分期标准进行系统分期,其中4例Ⅰ期,5例Ⅱ期,17例Ⅲ期,7例Ⅳ期；11例T1,6例T2,13例T3,3例T4,4例NO；5例N1,17例N2,7例N3；所有病例均为M0,病理学检测全部为未分化型鳞状细胞癌。33例患者年龄跨度为23-70岁,中位年龄为49岁,其中男16例,女17例。放疗方案：所有患者均于诱导化疗结束后5-15天内接受放射治疗。放射源使用直线加速器6MVX线。调强放疗组肿瘤区(GTV)处方量为68-72Gy,每次分割量为2.2-2.4Gy,每周照射5次。化疗方案：所有患者诱导化疗方案为铂类(顺铂/泉铂)+5-FU,剂量为:DDP60-100mg/m2d1+5-FU 500-1000mg/m2d2-5,部分患者在此基础上加上艾素/环磷酰胺,艾素的剂量为60-75mg/m2d1。同步化疗使用顺铂3周一次的化疗方案(顺铂50-80mg/m2)或顺铂每周一次的化疗方案(20-40mg/m2)。其中Ⅰ、Ⅱ期患者直接行放疗,Ⅲ、Ⅳ期行两个疗程诱导化疗后再行放疗。治疗前、诱导化疗后及放疗后分别于上午6时到9时之间采集外周血2mL, EDTA抗凝,2h内2000rpm,离心10 min,分离血浆并保存于-80℃冰箱备用。24名健康对照来自珠江医院耳鼻喉科住院患者,为慢性鼻窦炎、慢性中耳炎、声带息肉等常见病患者,本组征得南方医科大学珠江医院伦理委员会批准,并且经患者签署知情同意书。标本处理同前。采用实时荧光定量PCR技术(QPCR)检测33例鼻咽癌患者治疗(放疗或化疗)前后血浆中hTERT mRNA的表达,并分析其与临床病理因素的关联,以24例健康志愿者作为对照。2.外周循环肿瘤细胞中hTERT mRNA:入组患者为2013年9月至2014年6月南方医科大学珠江医院耳鼻喉科收治的鼻咽癌患者33例,同第一章中的纳入及排除标准,实验对象的33例患者同第一章。实验组患者取两管血液,第一管如第一章中的处理方法,收集血浆备用,第二管如下叙述,收集外周血单个核细胞,备用。患者均经病理学确诊为低分化型鳞状细胞癌且既往未经任何治疗。按鼻咽癌2008临床分期标准进行系统分期,其中4例Ⅰ期,5例Ⅱ期,17例Ⅲ期,7例Ⅳ期；11例T1,6例T2,13例T3,3例T4,4例NO；5例N1,17例N2,7例N3；所有病例均为M0,病理学检测全部为未分化型鳞状细胞癌。33例患者年龄跨度为23-70岁,中位年龄为49岁,其中男16例,女17例。同时,收集健康志愿者外周血标本20例,健康对照来自珠江医院耳鼻喉科住院患者,为慢性鼻窦炎、慢性中耳炎、声带息肉等常见病患者,本组征得南方医科大学珠江医院伦理委员会批准,并且经患者签署知情同意书。本研究通过了南方医科大学珠江医院医学伦理协会审核,病理标本的采集和检测实验均经患者知情同意。鼻咽患者治疗前后分别于上午6时到9时之间于外周静脉采血,采血时第1管血弃之不用,取第2管血2mL置入真空无菌肝素抗凝的试管。2小时内加入淋巴细胞分离液2500r/min离心20min后收集界面细胞,得到单个核细胞层(肿瘤细胞在此层),最后用PBS缓冲液洗涤一次,-80℃保存。20名健康对照来自珠江医院耳鼻喉科住院患者,标本处理同前。采用实时荧光定量PCR技术(QPCR)检测33例鼻咽癌患者治疗(放疗或化疗)前后循环肿瘤细胞中hTERT mRNA的表达,并分析其与临床病理因素的关联,以20例健康志愿者作为对照。结果：1.血浆中hTERT mRNA的实验结果显示,健康志愿者血浆中hTERT mRNA相对表达量为0.95±0.37,鼻咽癌患者血浆中hTERT mRNA含量达到10.75±4.29(P<0.05)。鼻咽癌患者血浆中hTERT mRNA的表达与年龄、性别无统计学差异(P>0.05),而与临床分期、T分期及N分期浸润范围有显著性差异(P<0.05)。早期患者(Ⅰ、Ⅱ期),放疗后其表达量(3.43±1.42)较治疗前(5.60±2.33)明显下降；晚期患者(Ⅲ、Ⅳ期)诱导化疗及放疗后其表达量较治疗前(12.68±3.08)分别降为10.68±2.48、3.13±1.69(P<0.05)。2.鼻咽癌外周循环肿瘤细胞的实验结果显示健康志愿者中hTERT mRNA相对表达量为分别为1.09±0.40,鼻咽癌患者外周血中hTERT mRNA含量分别达到10.65±4.28(P<0.05)。鼻咽癌患者外周血hTERT mRNA的表达与临床分期、肿瘤侵犯范围、淋巴转移及远处转移有显著性差异(P<0.05)。治疗后hTERT mRNA的表达量由10.65±4.28降低至5.59±2.32。3.血浆hTERT mRNA相对含量与外周血循环肿瘤细胞中hTERT mRNA相对含量之间具有相关性,两者之间的相关系数为0.981,高度相关。结论：鼻咽癌患者血浆和外周循环细胞中hTERT mRNA的表达明显升高,放化疗能够有效抑制该基因的表达,而且该基因的含量与肿瘤的临床分期、大小及淋巴结浸润范围等临床病理因素密切相关。鼻咽癌患者血浆和外周循环细胞中hTERT mRNA的表达明显升高从而提示检测鼻咽癌患者外周血中hTERT mRNA的含量,有可能为鼻咽癌患者早期诊断及治疗预后提供重要信息。鼻咽癌患者血浆和外周循环细胞中hTERT mRNA的表达也高度相关,可以部分解释血浆中hTERT mRNA的来源。