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自2010年10月起,猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)在中国严重爆发流行,之后,美国、墨西哥、加拿大、韩国、中国台湾等地也先后爆发不同程度的仔猪腹泻,对全球养猪业造成了严重的经济损失。本研究针对猪流行性腹泻主要开展了以下三个方面的工作:1.山东地区猪流行性腹泻感染情况调查为了分析猪流行腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)在山东地区的流行和遗传变异情况,对2013-2015年收集的510份临床腹泻样品,参照GenBank中已经发表的PEDV毒株的N基因序列,设计1对特异性引物,利用RT-PCR技术检测PEDV抗原,并对其中的16份阳性样品进行病毒分离与S1基因测序分析。临床检测结果表明:PEDV临床检出率由2013年的57.8%提高到2015年的77.94%,PEDV在山东地区的发病季节除春冬季节,夏季也呈高发趋势,且各地区均有不同程度的感染。S1基因序列分析结果表明,16株PEDV分离毒株间的S1基因的核苷酸序列同源性为91%~99.8%,氨基酸序列同源性为87.8%~99.7%;山东分离毒株与15个国内外参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为90.5%~100%和88.4~99.9%。对S基因分子流行病学分析发现,20个国外参考毒株、25个国内参考毒株与本次分离到的16个PEDV毒株被分为两个不同的进化分支G1和G2。在2013-2015年分离到的16株毒株中,有3株位于G1中,距离CV777经典毒株较近;其他的13株位于G2中,以近年流行毒株为主,而山东分离株主要在G2分支中,这也解释了现有CV777疫苗毒株在山东地区的免疫保护力不佳的原因。本研究结果从分子流行病学角度分析了山东地区PEDV的流行和变异情况,为指导该地区PEDV防控提供了参考依据。2.PEDV单克隆抗体的制备及鉴定本研究将猪流行性腹泻病毒变异株S蛋白上的一个抗原表位区(83~276aa)和N蛋白上的一个抗原表位区(126~328aa)分别扩增并连接到原核表达载体pET28a上,将构建好的重组质粒pET28a-MtS和pET28a-N分别转化到宿主表达菌BL21,经IPTG诱导,获得以可溶性形式表达的S蛋白片段和以包涵体形式表达的N蛋白片段。将两种重组蛋白片段纯化后,分别免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术,筛选获得两株能稳定分泌针对PEDV S蛋白抗原表位的杂交瘤细胞(分别命名为1E5和5B7)和三株能稳定分泌针对PEDV N蛋白抗原表位的杂交瘤细胞(分别命名为2E1、2B3和2B5)。针对S蛋白的两株杂交瘤细胞1E5和5B7细胞上清效价分别为1:125、1:100,诱导小鼠产生的腹水ELISA抗体效价分别为1:12500和1:10000,单抗亚类鉴定均为IgG1,轻链均为κ型。Western Blot结果表明两株单抗均能识别重组Mt S蛋白;间接免疫荧光试验显示,5B7与PEDV经典毒株(CV777)和变异株均有反应,而1E5只与PEDV变异株反应,不与经典毒株反应,结果表明这两株单抗所识别的S蛋白抗原位点不同。针对N蛋白的三株杂交瘤细胞2E1、2B3和2B5的细胞上清效价分别为1:256、1:128和1:128,诱导小鼠产生的腹水ELISA抗体效价分别为1:12500、1:10000和1:10000,单抗亚类鉴定分别为IgG1、IgG2b、IgG2a类,轻链均为κ型。Western blot和IFA试验结果显示三株单克隆抗体均具有良好的反应性和特异性。3.N蛋白间接ELISA的初步建立本研究以纯化的N蛋白作为包被原,建立了检测PEDV血清抗体的间接ELISA。通过优化各项反应条件,最终将间接ELISA的反应条件确定为:N蛋白抗原最佳包被量为1.5μg/mL,最佳包被条件为4℃包被过夜;最佳封闭液为5%脱脂奶粉37℃封闭1.5h;酶标二抗的最佳反应条件为1:3000稀释37℃反应1h;被检血清最佳反应条件为1:100稀释37℃反应1.5h;底物最佳条件为室温反应15min。当待检血清OD450值≥0.2008判定为阳性,带检血清≤0.1822判定为阴性,介于两者之间为可疑。比对试验结果表明,建立的间接ELISA具有良好的特异性、重复性和符合性,可用于临床上PEDV抗体水平的监测。