【摘 要】
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目的:血友病是由凝血因子缺失导致的一种X染色体隐性遗传的出血性疾病,目前血友病的治疗方法仍然是以输注凝血因子替代疗法为主,但这种传统疗法需要长期输注且费用较高,血友病作为单基因遗传病,基因治疗是其唯一治愈手段。在本研究中,我们选取实验室前期发现的一例无义突变（F8 c.2440C＞T）A型血友病患者为研究对象,利用尿液细胞重编程技术得到该患者来源的诱导多能干细胞（induced pluripote
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目的:血友病是由凝血因子缺失导致的一种X染色体隐性遗传的出血性疾病,目前血友病的治疗方法仍然是以输注凝血因子替代疗法为主,但这种传统疗法需要长期输注且费用较高,血友病作为单基因遗传病,基因治疗是其唯一治愈手段。在本研究中,我们选取实验室前期发现的一例无义突变（F8 c.2440C＞T）A型血友病患者为研究对象,利用尿液细胞重编程技术得到该患者来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSCs）,同时利用单碱基编辑系统中的胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine Base Editor,CBE）构建无义突变（F8 c.6682C＞T）A型血友病细胞模型,以期为无义突变所致血友病的致病机制、基因治疗和个性化治疗的研究奠定基础。方法:1.无义突变（F8 c.2440C＞T）A型血友病患者来源的i PSCs的建立及鉴定首先收集患者中段尿,将患者的尿液分离培养为尿液细胞,当细胞达到良好状态时转染重编程四因子OSKM,然后在干细胞样形态形成后挑取单克隆细胞扩增培养,此时尿液细胞已重编程为i PSCs,最后通过AP染色和核型分析验证诱导获得的i PSCs没有染色体畸变,初步判定具有多能性,并通过免疫荧光染色和畸胎瘤体外实验确定其多能性。2.利用CBE构建无义突变（F8 c.6682C＞T）A型血友病细胞模型设计特异靶向目标突变位点的sgRNA,与单碱基编辑系统YE1-BE3整合为打靶载体,利用三种转染试剂盒,在HEK-293T细胞上通过sgRNA靶向c.6682位点,使该位点发生C＞T无义突变。结果:1.成功从无义突变（F8 c.2440C＞T）A型血友病患者尿液细胞重编程得到人诱导多能干细胞（i PSCs）。2.成功构建无义突变（F8 c.6682C＞T）A型血友病细胞模型。结论:1.本研究利用ori P/EBNA1系统,将含有重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC的附加体质粒PEP4-EO2S-ET2K和p CEP4-M2L转染至尿液细胞,在无血清无滋养层细胞诱导的条件下,成功将尿液细胞重编程为具有多能性的人诱导多能干细胞（i PSCs）。2.利用CBE单碱基编辑系统,将YE1-BE3-sgRNA打靶载体转染进入HEK-293T细胞,成功构建无义突变（F8 c.6682C＞T）A型血友病细胞模型,从而证明单碱基编辑系统在HEK-293T细胞的编辑是可行且有效的。
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