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目的:应用稳定过表达GLUT4myc的L6-GLUT4myc大鼠骨骼肌细胞探讨传统型PKC(conventional PKC,cPKC)、新颖型PKC(novel PKC,nPKC)以及Rab蛋白在钙信号调节骨骼肌细胞葡萄糖转运子4(glucose transporter 4,GLUT4)胞内运输机制中的作用。方法:第一部分,用1mM钙离子载体ionomycin孵育L6-GLUT4myc成肌细胞,Western blot检测ionomycin对PKC底物磷酸化的影响,并用1mM cPKC和nPKC抑制剂G?6983和1mM cPKC抑制剂G?6976预孵育L6-GLUT4myc成肌细胞,ELISA测定细胞表面GLUT4水平及GLUT4的内吞和外排,Western blot检测PKC底物的磷酸化,探讨cPKC和nPKC是否参与ionomycin促进骨骼肌细胞GLUT4转位的作用。第二部分,应用RNA干扰技术分别下调PKCα、PKCζ和PKCε的蛋白表达,随机分为对照组和ionomycin组,ELISA测定ionomycin作用下的GLUT4转位以及GLUT4的内吞和外排,进一步探讨何种PKC亚型参与ionomycin促进骨骼肌细胞GLUT4转位的作用。第三部分,应用RNA干扰技术分别下调Rab8a、Rab13和Rab14的蛋白表达,随机分为对照组和ionomycin组,ELISA测定细胞表面GLUT4水平,探讨哪个Rab参与ionomycin促进骨骼肌细胞GLUT4转位的作用。结果:我们前期的研究结果显示:ionomycin升高L6-GLUT4myc成肌细胞胞浆Ca2+浓度,显著增加细胞表面GLUT4水平。第一部分结果显示:ionomycin显著增加PKC底物的磷酸化水平。G?6983和G?6976均显著抑制ionomycin促进的GLUT4myc转位(p<0.05,p<0.001)和PKC底物的磷酸化。Ionomycin抑制GLUT4myc内吞,促进GLUT4myc外排,G?6983既抑制ionomycin抑制的GLUT4myc内吞(p<0.01)也抑制ionomycin刺激的GLUT4myc外排(p<0.001)。G?6976抑制ionomycin抑制的GLUT4myc的内吞(p<0.05)但不影响ionomycin促进的GLUT4myc的外排。第二部分结果显示:siPKCα和siPKCζ均显著抑制ionomycin刺激的GLUT4myc转位(p<0.001),而siPKCε不影响ionomycin促进的GLUT4myc转位。siPKCζ既抑制ionomycin抑制的GLUT4myc内吞(p<0.001)也抑制ionomycin促进的GLUT4myc外排(p<0.001)。siPKCα抑制ionomycin抑制的GLUT4myc的内吞(p<0.001),但不影响ionomycin促进的GLUT4myc的外排。第三部分结果显示:siRab13显著抑制ionomycin促进的GLUT4myc转位(p<0.05),而siRab8a和siRab14不影响ionomycin刺激的GLUT4myc转位。结论:1.Ionomycin激活骨骼肌细胞PKC。2.cPKC和nPKC参与ionomycin促进GLUT4转位的作用,PKCα和PKCζ是起作用的PKC亚型。3.cPKC介导ionomycin抑制GLUT4内吞的作用,PKCα是起作用的cPKC亚型。nPKC参与ionomycin促进GLUT4外排及抑制其内吞的作用,PKCζ是起作用的nPKC亚型。4.Rab13介导ionomycin促进GLUT4转位的作用。综上,ionomycin通过PKCα/PKCζ-Rab13信号转导通路促进骨骼肌细胞GLUT4转位。