论文部分内容阅读
背景与目的:
食管癌（Esophagus Cancer）是一种全球性的恶性肿瘤。根据组织学特点，食管癌主要分为食管鳞状细胞上皮癌（Esophagus Squamous Cell Carcinoma，ESCC）和食管腺癌（Esophagus adenocarcinoma，EAC）两种。中国是食管癌的高发地区，其中尤以食管鳞状细胞癌为主。尽管食管癌的诊断和治疗方法得到了一定程度的改善，但因其发病隐匿和缺乏有效的治疗靶点，食管癌患者的5年生存率仍然很低，大约15-20%。因此了解食管癌尤其是ESCC发病的分子机制及寻找潜在治疗靶点对于食管癌的防治具有重要意义。
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)，作为一类与mRNA结构相似但却不编码蛋白的RNA分子，被发现参与多种分子细胞过程，调控多种生理病理过程。近年来，越来越多的研究表明lncRNA与肿瘤的发生发展具有相关性，甚至可以作为一些癌症的特异性生物标志物和潜在治疗靶点。长链非编码RNA LINC00152是一个位于人类基因组2号染色体（2p11.2）的新鉴定的lncRNA。研究发现LINC00152的高表达与多种癌症的发展、转移相关，包括胃癌、肝癌、结直肠癌、胆囊癌、肾癌、肺癌等。然而LINC00152在ESCC中的表达情况以及相关作用机制还不清楚。
因此本研究通过检测LINC00152在ESCC中的表达情况，分析LINC00152表达水平与临床病理特征的相关性；同时检测LINC00152在四种不同人源食管鳞癌细胞系（TE13，TE1，ECA-109和KYSE-410）中的表达情况，并进一步观察LINC00152敲降对ESCC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响；此外，又进一步通过芯片检测筛选与LINC00152发挥功能相关的差异表达基因，从而初步探讨LINC00152在ESCC中的作用及分子机制，为寻找ESCC的潜在生物标志物和治疗靶点提供依据。
方法:
1、采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测了69例ESCC和对应的癌旁组织中的LINC00152表达水平，并用ISH方法检测105例ESCC组织中的LINC00152表达水平进行验证；结合临床资料分析LINC00152表达量与临床病理特征的相关性。
2、采用qRT-PCR方法检测ESCC细胞系（TE13，TE1，ECA-109和KYSE-410）中LINC00152表达水平，利用特异性siRNA下调TE13和TE1细胞中LINC00152含量，并通过CCK-8增殖、流式周期和凋亡、和transwell迁移、侵袭等实验，观察LINC00152对ESCC细胞恶性生物学行为的影响。
3、采用芯片技术检测LINC00152敲降对ESCC细胞基因表达的影响，通过GO和KEGG分析，筛选与LINC00152影响细胞生物学行为相关的差异表达的基因，并进一步经蛋白免疫印迹方法验证，从而探讨LINC00152发挥作用的分子机制。
结果:
1、qRT-PCR结果显示，与癌旁组织相比，在69例ESCC组织中，76.81%(53/69)ESCC组织中的LINC00152表达量显著地升高（P=0.008）；ISH结果显示LINC00152在81.90%（86/105）ESCC组织中高表达，且LINC00152的高表达与ESCC的N期（P=0.03）、TNM（P=0.005）和低生存率（P=0.007）有关。
2、qRT-PCR结果显示，与HEEC细胞系相比，TE13,TE1和ECA-109细胞中LINC00152显著升高，而KYSE-410细胞中LINC00152水平明显下降；敲降LINC00152后，TE13和TE1细胞增殖、迁移和侵袭均受到抑制，细胞周期被阻滞在S期，而细胞凋亡水平无明显变化。
3、LINC00152敲降后的TE13和TE1细胞中有293个下调基因和441个上调基因。在生物学过程、分子功能和细胞成分三大类中，下调基因主要富集于细胞骨架组织、RNA激活酶Ⅱ转录辅助激活剂的活性和细胞核；上调基因则主要富集于凋亡过程、蛋白结合和细胞外空隙。下调基因富集的信号通路主要有生物素代谢通路、生理节律通路、不饱和脂肪酸的生物合成通路，而上调基因主要富集在TNF信号通路和突出囊泡循环通路。差异基因中与细胞周期通路（MAD2L1、CDK6）和囊泡运输过程SNARE相互作用的基因（STX3、STX12）的WB结果显示，在LINC00152敲降后，MAD2L1、CDK6和STX3蛋白水平明显升高（P＜0.05），而STX12蛋白水平则降低。
结论:
1、LINC00152在ESCC组织中的表达上调与ESCC的TNM分期和低生存率有关，提示异常表达的LINC00152可能作为诊断ESCC的生物标志物。
2、LINC00152在三种ESCC细胞系（TE13,TE1和ECA-109）中表达上调，并与TE13和TE1细胞的增殖、迁移和侵袭能力正相关；敲降LINC00152表达水平则使细胞阻滞在S期，提示LINC00152在ESCC发生、发展中可能发挥致癌基因的作用。
3、LINC00152在ESCC发生、发展中的作用可能与MAD2L1、CDK6、STX3和STX12表达改变有关，LINC00152可以作为ESCC潜在的治疗靶点。
食管癌（Esophagus Cancer）是一种全球性的恶性肿瘤。根据组织学特点，食管癌主要分为食管鳞状细胞上皮癌（Esophagus Squamous Cell Carcinoma，ESCC）和食管腺癌（Esophagus adenocarcinoma，EAC）两种。中国是食管癌的高发地区，其中尤以食管鳞状细胞癌为主。尽管食管癌的诊断和治疗方法得到了一定程度的改善，但因其发病隐匿和缺乏有效的治疗靶点，食管癌患者的5年生存率仍然很低，大约15-20%。因此了解食管癌尤其是ESCC发病的分子机制及寻找潜在治疗靶点对于食管癌的防治具有重要意义。
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)，作为一类与mRNA结构相似但却不编码蛋白的RNA分子，被发现参与多种分子细胞过程，调控多种生理病理过程。近年来，越来越多的研究表明lncRNA与肿瘤的发生发展具有相关性，甚至可以作为一些癌症的特异性生物标志物和潜在治疗靶点。长链非编码RNA LINC00152是一个位于人类基因组2号染色体（2p11.2）的新鉴定的lncRNA。研究发现LINC00152的高表达与多种癌症的发展、转移相关，包括胃癌、肝癌、结直肠癌、胆囊癌、肾癌、肺癌等。然而LINC00152在ESCC中的表达情况以及相关作用机制还不清楚。
因此本研究通过检测LINC00152在ESCC中的表达情况，分析LINC00152表达水平与临床病理特征的相关性；同时检测LINC00152在四种不同人源食管鳞癌细胞系（TE13，TE1，ECA-109和KYSE-410）中的表达情况，并进一步观察LINC00152敲降对ESCC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响；此外，又进一步通过芯片检测筛选与LINC00152发挥功能相关的差异表达基因，从而初步探讨LINC00152在ESCC中的作用及分子机制，为寻找ESCC的潜在生物标志物和治疗靶点提供依据。
方法:
1、采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测了69例ESCC和对应的癌旁组织中的LINC00152表达水平，并用ISH方法检测105例ESCC组织中的LINC00152表达水平进行验证；结合临床资料分析LINC00152表达量与临床病理特征的相关性。
2、采用qRT-PCR方法检测ESCC细胞系（TE13，TE1，ECA-109和KYSE-410）中LINC00152表达水平，利用特异性siRNA下调TE13和TE1细胞中LINC00152含量，并通过CCK-8增殖、流式周期和凋亡、和transwell迁移、侵袭等实验，观察LINC00152对ESCC细胞恶性生物学行为的影响。
3、采用芯片技术检测LINC00152敲降对ESCC细胞基因表达的影响，通过GO和KEGG分析，筛选与LINC00152影响细胞生物学行为相关的差异表达的基因，并进一步经蛋白免疫印迹方法验证，从而探讨LINC00152发挥作用的分子机制。
结果:
1、qRT-PCR结果显示，与癌旁组织相比，在69例ESCC组织中，76.81%(53/69)ESCC组织中的LINC00152表达量显著地升高（P=0.008）；ISH结果显示LINC00152在81.90%（86/105）ESCC组织中高表达，且LINC00152的高表达与ESCC的N期（P=0.03）、TNM（P=0.005）和低生存率（P=0.007）有关。
2、qRT-PCR结果显示，与HEEC细胞系相比，TE13,TE1和ECA-109细胞中LINC00152显著升高，而KYSE-410细胞中LINC00152水平明显下降；敲降LINC00152后，TE13和TE1细胞增殖、迁移和侵袭均受到抑制，细胞周期被阻滞在S期，而细胞凋亡水平无明显变化。
3、LINC00152敲降后的TE13和TE1细胞中有293个下调基因和441个上调基因。在生物学过程、分子功能和细胞成分三大类中，下调基因主要富集于细胞骨架组织、RNA激活酶Ⅱ转录辅助激活剂的活性和细胞核；上调基因则主要富集于凋亡过程、蛋白结合和细胞外空隙。下调基因富集的信号通路主要有生物素代谢通路、生理节律通路、不饱和脂肪酸的生物合成通路，而上调基因主要富集在TNF信号通路和突出囊泡循环通路。差异基因中与细胞周期通路（MAD2L1、CDK6）和囊泡运输过程SNARE相互作用的基因（STX3、STX12）的WB结果显示，在LINC00152敲降后，MAD2L1、CDK6和STX3蛋白水平明显升高（P＜0.05），而STX12蛋白水平则降低。
结论:
1、LINC00152在ESCC组织中的表达上调与ESCC的TNM分期和低生存率有关，提示异常表达的LINC00152可能作为诊断ESCC的生物标志物。
2、LINC00152在三种ESCC细胞系（TE13,TE1和ECA-109）中表达上调，并与TE13和TE1细胞的增殖、迁移和侵袭能力正相关；敲降LINC00152表达水平则使细胞阻滞在S期，提示LINC00152在ESCC发生、发展中可能发挥致癌基因的作用。
3、LINC00152在ESCC发生、发展中的作用可能与MAD2L1、CDK6、STX3和STX12表达改变有关，LINC00152可以作为ESCC潜在的治疗靶点。