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赭曲霉毒素A(OchratoxinA,OTA)是由青霉菌属和曲霉菌属产生的一组结构类似的有毒代谢产物之一。OTA具有强肾毒性和肝毒性,可导致巴尔干肾病,并有致畸、致突变和致癌作用。OTA在世界范围内污染谷物和大豆等饲料及食品,其广泛污染性和强毒性极大的影响了人类和动物的健康。在目前已知的真菌毒素家族中,根据其重要性及危害性排序,OTA位列第二仅次于黄曲霉毒素。OTA具有器官毒性、免疫毒性、细胞毒性、基因毒性,神经毒性等,目前OTA诱导细胞凋亡的机制仍不清楚,通过添加抗氧化物质干预OTA对细胞毒性作用的研究更少。本试验选用OTA的敏感细胞BHK作为研究对象,研究在不同浓度梯度OTA作用下,观察BHK细胞的形态学变化;检测OTA诱导BHK细胞凋亡途径中可能的关键凋亡蛋白Caspase-3,p53,Bax蛋白的表达情况来探讨OTA诱导BHK细胞凋亡的机制,为深入研究OTA肾毒性的毒理机制打下基础。通过检测乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)的释放,细胞增殖抑制率,超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)的活性等,探讨不同浓度梯度维生素C(VitaminC,VC)对不同浓度梯度的OTA作用BHK细胞的影响,为深入研究VC对OTA细胞毒性的干预提供依据。
试验Ⅰ:OTA诱导BHK细胞凋亡的形态学变化
本试验将处于对数生长期的BHK细胞以不同浓度的OTA进行处理,并设置空白对照组。24h后采用MTT法测定各浓度组毒素对BHK细胞的毒性作用;于倒置显微镜和荧光显微镜下观察BHK细胞的形态学变化(采用AO-EB染色法),并计数正常细胞,凋亡细胞,计算凋亡率。结果显示:随着OTA浓度的加大,细胞的增殖抑制率也逐渐增大,IC50为32μg·mL-1。随着OTA浓度的增加,BHK细胞数量减少,且部分细胞由梭形变成圆形,说明OTA抑制BHK细胞生长。荧光显微镜下,凋亡细胞的核被染成橘红色,染色质高度浓缩或片段化,核外周形成“新月状”,某些细胞出现凋亡小体。当OTA浓度在2.5~20μg·mL-1范围,凋亡率随OTA浓度的增加而升高;而当OTA浓度大于20μg·mL-1时,凋亡率反而下降。
试验Ⅱ:OTA诱导BHK细胞凋亡机制的研究
本试验将处于对数生长期的BHK细胞以不同浓度OTA进行处理,并设置空白对照组。24h后采用SDS-PAGE胶分离蛋白,Westernblotting记录Caspase-3,p53,Bax蛋白及内参蛋白β-actin的表达情况,使用Quantityone软件进行定量。结果显示:在2.5~10μg·mL-1范围内随着OTA浓度的升高,Caspase-3,p53,Bax蛋白的表达量均增加,且在10μg·mL-1时达到峰值。在20~40μg·mL-1范围内随着OTA浓度的升高,三者表达量下降,但均高于空白对照。其中当OTA浓度为5、10、20μg·mL-1时,Caspase-3相对表达量与对照组差异极显著(P<0.01);当OTA浓度为5、10μg·mL-1时,p53相对表达量与对照组差异极显著(P<0.01);当OTA浓度为5、10、40μg·mL-1时,Bax蛋白相对表达量与对照组差异极显著(P<0.01)。三者表达量的变化呈现正相关,因此关键凋亡蛋白的活化说明OTA诱导BHK细胞的凋亡途径很可能是线粒体途径。
试验Ⅲ:维生素C对OTA细胞毒性的干预作用
本试验将处于对数生长期的BHK细胞以不同浓度的VC进行预处理,并设置空白对照组。添加不同浓度的OTA处理24h后,MTT法检测细胞毒性变化,光学显微镜观察形态学变化,试剂盒检测乳酸脱氢酶的释放及SOD的活性。结果显示:当VC浓度≤50μmol·L-1时,对BHK细胞的增殖基本没有抑制,当VC浓度增加至100~200μmol·L-1时,细胞的增殖抑制率增加,但均低于10%。光学显微镜下,除200μmol·L-1外,其他浓度的VC对BHK细胞形态并无影响。当VC浓度≤50μmol·L-1、OTA浓度≤40μg·mL-1时,随着VC浓度的增加,细胞的增殖抑制率下降;当VC浓度为100~200μmol·L-1、OTA浓度≤10μg·mL-1时,BHK细胞的增殖抑制率均高于各组的空白对照。当OTA浓度≤20μg·mL-1、VC浓度≤200μmol·L-1时,乳酸脱氢酶释放较低;而OTA浓度为40μg·mL-1时,乳酸脱氢酶释放较高。当OTA浓度≤20μg·mL-1、VC浓度≤100μmol·L-1时,SOD的活性升高;当VC浓度为200μmol·L-1、OTA浓度为40μg·mL-1时,SOD活性下降至最低。总之,低浓度VC抑制OTA对BHK细胞的毒性作用,高浓度VC促进OTA对BHK细胞的毒性作用,甚至促进细胞凋亡或死亡。