论文部分内容阅读
基因表达调控是现代分子生物学研究的热点话题,随着研究手段的不断成熟,其中RNA转录后调控已成为备受关注的领域。RNA结合蛋白(RBPs)是转录后调控的关键因子,参与RNA可变剪切、RNA稳定、翻译等多个过程的调控,从而影响植物开花、生物胁迫、非生物胁迫等多个生长过程。ErbB3绑定蛋白(EBP1)是结构功能高度保守的RNA结合蛋白,可与rRNA、tRNA、mRNA等多种RNA结合,参与调控核糖体生物生成、蛋白质翻译多个过程,但目前已报道的靶RNA甚少,对靶RNA的作用机制目前仍不清楚。前期报道RALF1-FER信号促进EBP1蛋白积累进而促进其与下游靶基因启动子的结合,那RALF1-FER信号是否调控EBP1与RNA的结合能力,目前仍然未知。本研究不仅证实拟南芥EBP1具有结合RNA的功能,参与调控靶RNA的转录后事件,还显示EBP1可以响应RALF1信号促进靶RNA的绑定,进而促进对特定靶RNA转录后翻译过程的调控,为研究EBP1在转录后调控的生物学机制奠定基础。具体结果如下:
(1)成功的将拟南芥RALF1及EBP1CDS片段分别构建到pET-28a、pGEX-4T-1蛋白表达载体中,分别在28℃/6h、28℃/4h诱导条件下表达了出条带单一浓度较高的融合蛋白。
(2)Pfam预测拟南芥EBP1一级结构域发现,EBP1在48-56氨基酸区域含有结合RNA的保守结构域。将人类及拟南芥EBP1三维结构对比,发现二者高度保守且48-56氨基酸区域与已报道结合RNA的σ70-likemotif序列相似。
(3 )总RNA结合实验证实EBP1可以体外结合RNA;RNA-EMSA(RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay )实验结果显示:EBP1体外可直接结合“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”RNA序列;
(4)NCBI找到12个EBP1潜在结合的RNA序列,通过RNA免疫沉淀(RIP)实验获得了EBP1免疫结合的三个靶RNA(AT1G24792、AT3G24320、AT3G25211);
(5)虫草素处理实验发现,EBP1促进AT1G24792、AT3G24320的mRNA的降解,而对AT3G25211的mRNA稳定性没有影响。通过核糖体提取实验发现EBP1抑制AT1G24792、AT3G24320的mRNA与核糖体结合,而促进AT3G25211的mRNA与核糖体结合;
(6)RALF1处理结合RNA免疫沉淀实验显示RALF1增强EBP1与靶RNA的结合;进一步研究RALF1-FER信号是否调控EBP1参与的RNA转录后事件,结果发现在RNA稳定性方面,与对照相比,RALF1处理加速AT1G24792、AT3G24320的mRNA的降解,对AT3G25211的mRNA稳定性没有影响;在调控翻译速率方面,RALF1处理促进AT1G24792、AT3G24320的mRNA在多聚核糖体组分的含量减少,AT3G25211的mRNA与在多聚核糖体含量增多。
综上所述,拟南芥EBP1作为一个RNA结合蛋白,响应RALF1信号参与调控下游靶基因mRNA稳定性与翻译速率,为研究EBP1的生物学功能提供了新的方向。
(1)成功的将拟南芥RALF1及EBP1CDS片段分别构建到pET-28a、pGEX-4T-1蛋白表达载体中,分别在28℃/6h、28℃/4h诱导条件下表达了出条带单一浓度较高的融合蛋白。
(2)Pfam预测拟南芥EBP1一级结构域发现,EBP1在48-56氨基酸区域含有结合RNA的保守结构域。将人类及拟南芥EBP1三维结构对比,发现二者高度保守且48-56氨基酸区域与已报道结合RNA的σ70-likemotif序列相似。
(3 )总RNA结合实验证实EBP1可以体外结合RNA;RNA-EMSA(RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay )实验结果显示:EBP1体外可直接结合“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”RNA序列;
(4)NCBI找到12个EBP1潜在结合的RNA序列,通过RNA免疫沉淀(RIP)实验获得了EBP1免疫结合的三个靶RNA(AT1G24792、AT3G24320、AT3G25211);
(5)虫草素处理实验发现,EBP1促进AT1G24792、AT3G24320的mRNA的降解,而对AT3G25211的mRNA稳定性没有影响。通过核糖体提取实验发现EBP1抑制AT1G24792、AT3G24320的mRNA与核糖体结合,而促进AT3G25211的mRNA与核糖体结合;
(6)RALF1处理结合RNA免疫沉淀实验显示RALF1增强EBP1与靶RNA的结合;进一步研究RALF1-FER信号是否调控EBP1参与的RNA转录后事件,结果发现在RNA稳定性方面,与对照相比,RALF1处理加速AT1G24792、AT3G24320的mRNA的降解,对AT3G25211的mRNA稳定性没有影响;在调控翻译速率方面,RALF1处理促进AT1G24792、AT3G24320的mRNA在多聚核糖体组分的含量减少,AT3G25211的mRNA与在多聚核糖体含量增多。
综上所述,拟南芥EBP1作为一个RNA结合蛋白,响应RALF1信号参与调控下游靶基因mRNA稳定性与翻译速率,为研究EBP1的生物学功能提供了新的方向。