【摘 要】
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目的构建屎肠球菌介导的铜绿假单胞菌脯氨酰寡肽酶B（PopB）疫苗,初步探讨其对小鼠的保护性免疫机制。方法以铜绿假单胞菌PA01株DNA为模板,PCR扩增获得PopB基因,插入pGEX-1λT得pGEX-PopB,将该质粒转化E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定其表达产物。电穿孔将pGEX-PopB导入Ef,构建重组Ef-PopB疫苗
【基金项目】
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重庆市科委地方病重大专项基金项目（No.2008AB5055,2008AB5008,2008AB5054）；
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目的构建屎肠球菌介导的铜绿假单胞菌脯氨酰寡肽酶B（PopB）疫苗,初步探讨其对小鼠的保护性免疫机制。方法以铜绿假单胞菌PA01株DNA为模板,PCR扩增获得PopB基因,插入pGEX-1λT得pGEX-PopB,将该质粒转化E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定其表达产物。电穿孔将pGEX-PopB导入Ef,构建重组Ef-PopB疫苗,经双酶切和PCR鉴定后,分析和鉴定其诱导表达情况。取重组Ef-PopB疫苗灌胃免疫小鼠,PA01株攻击后14 d杀鼠,分离血清,ELISA法检测其抗体水平,摘除肺计数其载菌量,摘除脾制备其细胞悬液,用Pa Ag和Con A刺激培养,MTT法和FCM检测脾细胞的亚群、增殖及凋亡,PCR检测脾CK水平。结果成功扩增1200 bp的PopB基因;PopB基因插入pGEX-1λT中并转化BL21;SDS-PAGE分析重组菌表达的PopB蛋白Mr约为66 KDa,其表达产物占总菌体量的20%;Western blot证实该蛋白具有免疫反应性。重组质粒pGEX-PopB成功转化Ef,SDS-PAGE分析重组Ef（pGEX-PopB）疫苗表达的PopB Mr约为66 KDa,与预期结果一致,且能被Pa外膜粗抗原免疫鼠血清特异性识别。与对照组相比,疫苗组的肺载菌量降低;血清特异性抗体Ig G及其亚类和Ig E水平升高;脾CD4+T细胞百分率上升,脾细胞增殖,而其凋亡率降低;疫苗组的脾细胞可成功扩增IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-12和Foxp3基因片段。结论成功构建重组Ef（pGEX-PopB）疫苗,该疫苗可为Pa感染的小鼠提供有效的保护效应,并诱导Th1和Th2混合型的免疫应答。
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