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研究背景糖尿病足是指糖尿病患者踝关节以下的皮肤及其深层组织破坏,常合并有不同程度的末梢血管病变和神经病变,导致下肢感染、溃疡和（或）深部组织破坏的一种疾病。糖尿病足作为糖尿病最常见、最严重的慢性并发症,为患者甚至社会带来严重的负担。创面恢复通常会经历止血、炎症、增殖和重塑四个过程,这个复杂的过程被很多因素所影响,而糖尿病创面因为其高血糖导致的微环境变化愈合可能更难。中性粒细胞对损伤反应过度也是糖尿病足创面延迟愈合的一个重要原因,它可能导致组织的反复损伤,引起慢性炎症。炎症是创面愈合需要经历的一个典型过程,而中性粒细胞被早期募集到伤口床,它对损伤的过度反应可激活中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps,NETs）。NETs可以存在于患者血清或者创面组织中,具有DNA网状结构和组蛋白3、弹性蛋白酶等构成。高血糖微环境也进一步刺激中性粒细胞生成NETs,持续存在或沉积过多的NETs可导致组织损伤和细胞毒性损伤从而延缓糖尿病创面愈合,故抑制NETs生成可促进创面愈合。有报道提示人羊膜上皮细胞可调节炎症反应和促进新生血管生成促进创面愈合,也可通过外泌体分泌促进成纤维细胞和内皮细胞的生物学功能。那人羊膜上皮细胞运用于创面治疗时是否通过抑制NETs生成促进创面愈合却鲜有报道。研究目的1.明确糖尿病足患者血清NETs的含量水平。2.细胞实验:提取人羊膜上皮细胞、人中性粒细胞并鉴定;建立体外NETs模型;收集24小时和48小时人羊膜上皮细胞的条件培养基干预NETs,观察其对NETs的作用。3.探究人羊膜上皮细胞对糖尿病大鼠创面愈合的影响,并探究其机制是否与抑制NETs生成相关。研究方法本文主要通过人体研究糖尿病患者和糖尿病足两类人群、细胞实验、动物实验进行了探讨。1.人群研究:收集糖尿病患者53人、糖尿病足患者53人,抽取外周静脉血分离血清,利用Pico Green与ds DNA结合发出荧光检测520/480 nm荧光值,得出血清ds DNA含量,并比较两组ds DNA含量差异。2.细胞实验:1)收集足月剖宫产术中胎盘钝性分离羊膜,通过二次胰蛋白酶消化法提取人羊膜上皮细胞,用免疫荧光法检测细胞角蛋白19（Cytokeratin19,CK19）表达,流式细胞学分析仪检测SSEA-4、CD29、CD105、CD45的表达来鉴定人羊膜上皮细胞的纯度;2)抽健康成年人的外周静脉血分离人中性粒细胞并用流式细胞仪检测CD11b的表达鉴定其纯度,然后用25n M PMA体外诱导NETs,同时通过检测ds DNA含量、Sytox Green荧光观察NETs形态;3)收集24小时和48小时人羊膜上皮细胞的条件培养基,用其干预NETs。对照组用25n M PMA刺激NETs生成,用高糖DMEM干预;24h CM-h AECs组用25n M PMA刺激NETs生成,同时用已经收集保存完好的无血清培养24小时的人羊膜上皮细胞培养基（24h CM-h AECs）干预;48h CM-h AECs组用25n M PMA刺激NETs生成,同时用已经收集保存完好的无血清培养48小时的人羊膜上皮细胞培养基（48h CM-h AECs）干预;空白对照组（Blank）未用PMA刺激,用高糖DMEM干预。用Sytox Green荧光、免疫蛋白印迹检测NETs相关蛋白中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase,NE）、组蛋白3（Citrullinated histone 3,Cit-H3）的表达观察其对NETs的作用。3.动物实验:1)选取6-8周的SD大鼠,腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导糖尿病模型,造模成功的标准是连续一周尾部静脉血糖≥16.7mmol/L;2)在大鼠背面做10mm×10mm的正方形标记,局部消毒后然后沿着标记线小心剪去全层皮肤直达皮下筋膜建立糖尿病大鼠创面模型,将人羊膜上皮细胞混悬液局部注射在创面皮肤周围皮下,观察创面第5天、第10天的愈合率,并通过免疫蛋白印迹法检测第5天、第10天的创面组织NE、Cit-H3的表达。研究结果1.糖尿病足患者血清ds DNA浓度明显高于无糖尿病足的糖尿病患者[1067.68（924.06,1258.83）vs 966.72（839.19,1083.18）,P=0.0011]。糖尿病足患者人群中行ds DNA浓度影响因素的相关性分析发现ds DNA浓度与Wagner分级成正相关（r=0.463,P=0）,Wagner分级越高,ds DNA浓度越高,这提示ds DNA浓度越高,糖尿病足可能越严重。2.我们体外成功分离人羊膜上皮细胞,流式细胞仪检测高表达SSEA-4、CD29,不表达CD45、CD105,免疫荧光检测CK19表达阳性,提示人羊膜上皮细胞纯度高。3.体外成功分离人中性粒细胞,流式细胞学分析CD11b阳性表达率99.7%,并用不同浓度PMA刺激中性粒细胞120分钟,通过Sytox Green荧光显示NETs的形态,镜下可观察到绿色网状和丝状结构为NETs,NETs模型成功诱导。且根据PMA浓度的增加,NETs生成逐渐增多,但是浓度至75n M PMA之后NETs生成量稍有下降后逐渐趋于平衡,NETs生成量不随浓度增加而增加。4.分别设置对照组（CTL）、24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组、空白对照组（Blank）四个组,通过Sytox Green染色结果显示对照组与空白对照组比较,对照组NETs生成明显增多,且有统计学差异（P<0.0001）,这提示NETs体外模型建立成功。24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组与对照组比较NETs明显减少,且有统计学差异（P<0.0001）。24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组两组比较,48h CM-h AECs组抑制NETs更明显,且具有统计学差异（P=0.0225）。按上述方案分组分别提取每个组的ds DNA通过Pico Green与ds DNA结合发出的荧光值计算出ds DNA浓度。结果提示对照组比空白对照组ds DNA浓度明显升高,且有统计学差异（P=0.0001）。24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组与对照组比较ds DNA浓度明显降低,且有统计学差异（P=0.006、P=0.0002）。24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组两组ds DNA浓度无统计学差异。5.通过ELISA检测24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组发现TSG-6含量比对照组升高。6.人羊膜上皮细胞可促进糖尿病大鼠创面愈合,第5天、第10天创面愈合率明显高于对照组。免疫蛋白印迹试验检测提示人羊膜上皮细胞治疗组第5天、10天创面组织NETs相关蛋白Cit-H3、NE的表达明显减少,提示人羊膜上皮细胞可能通过抑制NETs生成促进糖尿病创面愈合。研究结论本研究证实糖尿病足患者血清ds DNA含量明显升高。人羊膜上皮细胞可能通过抑制NETs生成而促进糖尿病创面愈合。同时发现抑制NETs可能与TSG-6相关,这也为治疗糖尿病创面提供新的治疗策略和治疗靶点。