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第一部分GPR120在癫痫脑中的表达和分布目的:主要检测GPR120在癫痫小鼠脑组织和癫痫患者脑组织中的表达、分布和定位情况。方法:1.对雄性C57BL/6成年小鼠颅内注射海人酸(KA)建立颞叶癫痫模型(TLE),在建立模型后1、3、7、14、21、28天取小鼠海马及皮质组织,进行免疫印迹实验检测其表达变化。2.在脑库中随机选取10例TLE癫痫患者和10例正常对照的脑组织,进行免疫组织化学染色,验证GPR120在人脑中的表达变化。3.在GPR120表达最高的时间点取小鼠完整全脑,进行免疫荧光实验,检测GPR120在癫痫小鼠海马中的分布和定位情况。结果:1.免疫印迹实验显示GPR120在癫痫小鼠模型的海马和皮质中均表达升高,且均在注射后第7天表达最高。2.免疫组织化学染色显示人脑组织的结果与动物模型中的结果一致,与正常对照组相比,GPR120在癫痫患者的脑组织中表达增加。3.免疫荧光染色显示,GPR120主要在癫痫相关的海马CA1和CA3区表达,并与神经元共定位,且不与小胶和星胶共定位。结论:GPR120在癫痫小鼠模型和癫痫患者脑组织中表达增高,并在癫痫相关的海马CA1和CA3区与神经元共定位,这说明GPR120可能参与癫痫活动。第二部分GPR120对癫痫发作、癫痫持续状态后神经元死亡和癫痫中神经炎症的影响目的:为探讨GPR120在癫痫发作中的作用,接下来我们使用腺相关病毒对GPR120进行过表达和敲低,探究GPR120在KA诱导的TLE癫痫模型中对癫痫发作、癫痫持续状态(SE)后神经元损伤及神经炎症的影响。方法:1.取雄性成年C57BL/6小鼠,分别颅内注射GPR120过表达病毒(GPR120-AAV-OE)、过表达病毒空载体(Con-AAV-OE)、GPR120敲低病毒(GPR120-AAV-KD)、敲低病毒空载体(Con-AAV-KD),3周后颅内注射KA建立癫痫模型,视频监控动物发作情况,1个月后进行局部场电位记录。2.取注射过腺相关病毒的小鼠,制备离体脑片。在无Mg2+条件下用全细胞膜片钳记录GPR120-AAV-OE、GPR120-AAV-KD干预后CA1椎体神经元的微型兴奋性突触后电流(m EPSCs)和微型抑制性突触后电流(m IPSCs)。3.取注射过腺相关病毒和KA的小鼠,在SE诱导1个月后,通过尼氏染色检测神经元存活数量。4.取注射过腺相关病毒和KA的小鼠,在KA注射后第7天,使用免疫印迹实验检测白介素-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)、白介素-6(IL-6)的水平。结果:1.局部场电位(LFP)和行为学监控结果均观察到所有小鼠出现频繁的反复癫痫发作样事件(SLEs)。通过LFP对SLEs进行了30分钟的分析,发现发作平均时间在各组之间没有差异,但是,与Con-KD组相比,KD组在30分钟内SLE数量增加,且在SLE中的总时间增加。与Con-OE组相比,OE组在30分钟内SLE数量增加,且在SLE中的总时间减少。2.全细胞膜片钳记录显示,与Con-KD组和Con-OE组相比,KD组m EPSC的频率和幅度增高,OE组m EPSC的频率和幅度降低,但是GPR120-AAV-KD和GPR120-AAV-OE皆不影响m IPSC的频率和幅度。3.尼氏染色结果显示,与正常对照组和癫痫组相比,KD组小鼠海马CA1区、CA3区、DG区神经元数量明显减少,而OE组的结果则恰好相反,与Con-OE组相比,OE组小鼠海马CA1区、CA3区、DG区神经元数量明显减少,且与正常对照组无明显差别。4.免疫印迹结果显示,与正常对照组(Control组)相比,颅内注射Con-AAV-KD和Con-AAV-OE的TLE癫痫模型组(Con-KD组和Con-OE组)小鼠海马中细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6水平皆显著升高。与Control组和Con-KD组相比,颅内注射GPR120-AAV-KD的TLE癫痫模型组(KD组)小鼠海马细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6水平皆显著升高。相反,与Con-OE组相比,颅内注射GPR120-AAV-OE的TLE癫痫模型组(OE组)小鼠海马细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6水平显著降低,且与Control组相比无统计学意义。结论:GPR120可以影响癫痫发作活动及SE后的神经元损伤和神经炎症,敲低GPR120可加重癫痫发作活性,过表达GPR120可以减轻癫痫发作活性。在神经传递方面,GPR120主要影响兴奋性突触传递,对抑制性突触的传递无显著调节作用。第三部分GPR120通过激活NLRP3炎性小体促进IL-1β和IL-18在癫痫中的神经炎症目的:为了进一步探讨GPR120影响癫痫发作的机制,基于NLRP3炎性小体在神经炎症中的重要作用,我们在本部分探究GPR120对NLRP3炎性小体及其下游信号通路的影响。方法:1.取雄性成年C57BL/6小鼠,分别颅内注射GPR120过表达病毒(GPR120-AAV-OE)、过表达病毒空载体(Con-AAV-OE)、GPR120敲低病毒(GPR120-AAV-KD)、敲低病毒空载体(Con-AAV-KD),3周后颅内注射KA建立癫痫模型,在KA注射后第7天,通过免疫印迹检测小鼠海马中NLRP3、Caspase-1、ASC的表达变化。2.取雄性成年C57BL/6小鼠,分别颅内注射GPR120敲低病毒(GPR120-AAV-KD)、敲低病毒空载体(Con-AAV-KD),3周后颅内注射KA建立癫痫模型,采用灌胃给药的方式对部分注射GPR120-AAV-KD的癫痫小鼠进行VX765的灌胃干预(KD+KA+VX765组),另一部分注射GPR120-AAV-KD的癫痫小鼠(KD+KA组)及注射Con-AAV-KD的癫痫小鼠(KA组)灌胃给予等量的玉米油溶剂。在KA注射后第7天,通过免疫印迹检测各组小鼠海马中IL-1β、IL-18、IL-6的表达变化,行为学监控观察癫痫发作活动,尼氏染色检测神经元存活情况。结果:1.免疫印迹结果显示,与第二部分中炎症因子的结果一致,与Control组相比,Con-KD组和Con-OE组小鼠海马中NLRP3、ASC、Caspase-1水平显著增高。与Control组和Con-KD组相比,KD组小鼠海马中NLRP3、ASC、Caspase-1水平皆显著升高。然而,与Con-OE组相比,OE组小鼠海马中NLRP3、ASC、Caspase-1水平皆显著降低,且与Control组相比无统计学意义。2.VX765灌胃给药后的免疫印记结果显示,与KD组的小鼠相比,KD+KA+VX765组的小鼠脑中的IL-1β和IL-18水平显著降低,且与KA组相比无统计学意义。而VX765对注射GPR120-AAV-KD的小鼠海马IL-6水平的影响较小。3.Nissl染色的结果显示,与KD组相比,KD+KA+VX765组小鼠海马CA1、CA3、DG区神经元存活数量显著增加,且与KA组相比无统计学差异。4.行为学监控显示,与KA+KD组小鼠相比,KA+KD+VX765组小鼠潜伏期延长,发作频率降低,与KA组相比无统计学差异。结论:GPR120可以调节NLRP3炎性复合体的激活,VX765可以挽救GPR120-AAV-KD在癫痫小鼠海马中引起的神经炎症和神经元死亡。