研究背景:一般情况下,角膜是无血管,透明的,是眼屈光系统的重要组成部分。角膜新生血管（Corneal Neovascularization,CNV）是一种常见的眼部病变,是全球视力损害的第四大原因,也是临床上最难治愈的疾病之一。CNV可由多种原因引起,包括感染、炎症、化学损伤等。目前治疗CNV的方法包括外用类固醇和非类固醇抗炎药物、激光烧灼、细针透热、羊膜移植、抗血管内皮生长因子（vascular endothelia growth factor,VEGF）甚至基因治疗。然而,上述所有方法的效果都是有限的,而且都有相关的副作用。因此,研究CNV发病机制和探讨有效的治疗措施,寻找副作用更少的替代药物,将对防治CNV、防盲、治盲都具有极其重要的现实意义。炎症是CNV形成的关键病理过程,主要机制是促血管生成因子和抗血管生成因子之间的失衡。VEGF-A的梯度触发单个内皮细胞的选择,使其成为引导发芽的尖细胞。尖细胞和茎细胞始终保持一定比例的动态平衡协作促进新生血管形成。但是,尖细胞和茎细胞的选择机制目前还不清楚。CNV形成过程中常伴有中性粒细胞的过度浸润。中性粒细胞通过产生中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps,NETs）诱导炎症反应的无序扩张和CNV形成。并且NETs在多种疾病进程中发挥促血管生成的作用。目前,尚未见到NETs在角膜缝线模型中对CNV影响的报道。角膜上皮顶端连接复合体（Apical Junctional Complexes,AJCs）是维持角膜屏障功能的关键结构。它由角膜上皮细胞下面的粘附连接和顶部的紧密连接组成。导致CNV的各种病因对角膜上皮AJCs产生不同程度的损伤。AJCs的损伤可进一步加速CNV的发展。因此,保持角膜的正常结构和功能依赖于AJCs的完整,修复受损的上皮AJCs有助于防止CNV的形成。骨形成蛋白4（Bone morphogenetic protein 4,BMP4）作为细胞因子参与细胞分化、增殖、转移和凋亡,在组织愈合和血管生成中发挥特殊的调节作用。课题组前期发现BMP4可以显著减少CNV的形成,下调VEGF-A的表达,促进角膜上皮愈合。然而,BMP4抑制CNV形成的具体机制尚不清楚。目的:本课题从建立角膜缝线诱导CNV模型着手,探讨BMP4对CNV形成过程中NETs的调节机制及对尖细胞的影响,研究BMP4是否通过修复角膜上皮AJCs抑制CNV形成,并且将BMP4加载到F127-OSA温敏水凝胶中,延长药物在眼表的停留时间,提高其使用效率。方法:1、培养人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）,应用VEGF-A体外诱导HUVECs新生血管模型。通过CCK-8实验检测细胞的增殖能力,确定VEGF-A的最佳实验浓度。利用管腔形成实验观察细胞增殖、迁移、成管,研究BMP4对血管生成的影响。此外,应用CD34和鬼笔环肽免疫荧光共染色分析BMP4对CD34染色尖细胞形成的影响。2、建立缝线诱导的大鼠CNV模型,在wistar大鼠距角膜缘1.5 mm处放置3条间断的10-0缝线诱导CNV。实验分为空白对照组（Untreated）、缝线对照组（Suture）、溶剂对照组（BMP4 solvent）和BMP4组（BMP4）。造模后左眼滴入20μg/ml BMP4作为BMP4组,右眼滴入缓冲液（0.1%牛血清白蛋白,4 m M HCl）作为溶剂对照组,每次5μl,每天3次,连续3、5、7天。另设缝线对照组（造模后不给药）3、5、7天,空白对照组（不造模,不给药）。分别在造模后第3、5、7天通过裂隙灯生物显微镜拍摄照片进行角膜分析。根据新生血管的长度、面积和分叉点的数量来确定新生血管的CNV程度;应用HE染色切片观察角膜上皮的形态变化及炎症反应;Western Blot实验检测VEGF-A及VEGFR2的表达情况;通过电镜观察CNV中新生血管的形成方式。用免疫荧光染色检测缝线刺激后及BMP4点眼后MPO、Histone H3的表达情况。3、建立缝线诱导的大鼠CNV模型,实验分为空白对照组（Untreated）、缝线对照组（Suture）、溶剂对照组（DMSO solvent）和DPI组（DPI）。为了研究NADPH氧化酶（NADPH Oxidases,NOX）在缝线诱导的CNV中的作用,将NOX抑制剂DPI用于滴眼液中。造模后立即滴入DPI滴眼液,每日4次,连用7天。用等量DMSO浓度的生理盐水作为对照。通过免疫荧光染色检测各组MPO及Histone H3的表达情况;Western Blot实验检测NOX-2的表达情况。4 、建立缝线诱导的大鼠CNV模型,实验分为空白对照组（Untreated）、缝线对照组（Suture）、溶剂对照组（BMP4 solvent）和BMP4组（BMP4）。应用Western Blot实验检测NOX-2的表达情况。5、建立缝线诱导的大鼠CNV模型,实验分为空白对照组（Untreated）、缝线对照组（Suture）、溶剂对照组（BMP4 solvent）和BMP4组（BMP4）。造模7天后开始点药,一天3次,3天后取大鼠角膜组织,进行circ RNA微阵列芯片分析,选出目的基因,进一步验证。6、建立缝线诱导的大鼠CNV模型,实验分为空白对照组（Untreated）、缝线对照组（Suture）、溶剂对照组（BMP4 solvent）和BMP4组（BMP4）。通过免疫荧光染色和Western Blot实验,检测在造模7天后,紧密连接蛋白ZO-1和粘附连接蛋白E-cadherin、β-catenin的表达量。7、建立缝线诱导的大鼠CNV模型,实验分为空白对照组（Untreated）、缝线对照组（Suture）、凝胶组（Gel）、BMP4组（BMP4）和BMP4+凝胶组（BMP4+Gel）。分别在造模后第3、5、7天通过裂隙灯生物显微镜拍摄照片进行角膜分析;HE染色切片观察角膜上皮的厚度和上皮细胞的形态。并且在造模后第7天用透射电镜观察各组角膜上皮的损伤及修复情况。结果:1、CCK-8实验结果显示,2、5 ng/ml VEGF-A均不能显著促进HUVECs的增殖,而10、20、50、100 ng/ml VEGF-A均能显著提高HUVECs的增殖率。说明不同浓度的VEGF-A对HUVECs的增殖有显著影响。我们研究了20、50和100 ng/ml VEGF-A对HUVECs增殖的促进作用,发现20 ng/ml VEGF-A是促进HUVECs增殖的最佳浓度。体外管腔形成实验表明,VEGF-A对照组HUVECs在每张图像中形成多个密集排列的管腔结构,而20μg/ml BMP4组的管腔结构更少,排列更稀疏。2、免疫荧光染色法显示与对照组相比,BMP4组CD34的表达量明显降低,CD34+尖细胞的丝状形态也明显减少。3、体内实验中,对裂隙灯拍摄的照片进行统计分析,发现随着造模时间的延长,CNV百分比逐渐增加。与溶剂对照组和缝线对照组相比,BMP4组第5天CNV的长度、面积和密度均明显减少。HE切片染色显示BMP4组的管腔小于缝线对照组和溶剂对照组。在溶剂对照组和缝线对照组中,角膜基质层有大量炎症细胞浸润。BMP4组第3天的炎症细胞数量显著降低。通过Western Blot实验,发现角膜缝线可诱导VEGF-A及VEGFR2表达量升高,BMP4点眼3天时,BMP4组VEGF-A和VEGFR2的表达量明显低于溶剂对照组和缝线对照组。利用电镜对角膜超微结构的观察,发现与溶剂对照组相比,BMP4组血管新生芽较少,与溶剂对照组相比,BMP4组血管新生较早出现肠套叠。4、通过大鼠角膜的免疫荧光染色显示,随着时间的推移,缝线对照组角膜基质中明显积累了以DNA、MPO和Histone H3标记的网状NETs结构。而BMP4组中,DNA与MPO和Histone H3的细胞外共定位较少。5、大鼠角膜免疫荧光染色结果显示,DPI可减少NETs的形成。Western Blot实验检测结果显示,缝线诱导CNV后大鼠角膜中NOX-2表达上调,DPI抑制NOX-2表达。6、大鼠角膜Western Blot实验检测结果显示,BMP4组NOX-2的表达量相比较缝线对照组和溶剂对照组也有所下降。7、CircRNA微阵列芯片分析。第一步通过分层聚类分析、火山图、散点图显示了BMP4组与缝线对照组相比差异表达的circ RNA,并通过t检验筛选出缝线对照组相比空白对照组下调的circ RNA,排除溶剂的影响后,并在BMP4组里上调的circ RNA。第二步通过RT-q PCR试验验证,选出circ＿009413为我们的研究对象。根据ce RNA调控机制,rno＿circ RNA＿009413可以通过海绵吸附作用靶向micro RNA,进而对下游靶基因Raf1的表达量进行调控。利用Western Blot实验检测空白对照组（Untreated）、缝线对照组（Suture）、溶剂对照组（BMP4 solvent）和BMP4组（BMP4）中Raf1的表达量。结果显示缝线会导致Raf1表达量增加,而BMP4组Raf1表达量明显减少。8、造模3天后,缝线对照组与溶剂对照组角膜上皮细胞间连接疏松,呈空泡状,细胞间连接数量明显减少。BMP4点眼后细胞组织整齐,细胞间连接紧密。缝线对照组和溶剂对照组的ZO-1、E-cadherin、β-catenin的表达水平也明显低于空白对照组,而BMP4点眼可显著提高上述蛋白的表达水平。9、造模后第3、5、7天,采用裂隙灯评价CNV状态。随着刺激时间的延长,CNV的长度和面积逐渐增大。造模后第5天,BMP4+Gel组CNV长度和面积明显减少相比于BMP4组。通过HE切片染色,发现缝线对照组和凝胶对照组角膜上皮细胞生长异常,组织紊乱。BMP4滴眼液和BMP4温敏水凝胶可抑制角膜上皮细胞的异常增殖和不规则排列。此外,缝线后角膜上皮的厚度显著增加,并随着刺激时间的延长而持续增长。在所有时间段,BMP4滴眼液和BMP4温敏水凝胶显著降低角膜上皮厚度,减轻角膜水肿,使角膜厚度恢复正常水平。BMP4温敏水凝胶在第5天的表现优于BMP4滴眼液。10、在造模后第7天用透射电镜观察各组角膜上皮。未治疗组角膜上皮微绒毛数量多且组织整齐,而缝线对照组和凝胶对照组角膜上皮微绒毛扁平,有明显脱落和融合。BMP4滴眼液和BMP4温敏水凝胶可以改善上皮细胞的形态和排列,修复受损的微绒毛。空白对照组细胞间连接紧密,细胞核和核膜完整,染色质致密,细胞结构典型。缝线组细胞间隙明显增大,细胞间连接处破坏,染色质异常,核膜增宽,细胞质局部溶解,粗面内质网扩大,线粒体肿胀。然而,BMP4滴眼液和BMP4温敏水凝胶可用于修复上述损伤,温敏水凝胶的修复效果优于滴眼液。空白对照组半桥粒连接紧密,基底膜连续完整,基底细胞分布整齐。缝线后基底膜破裂,半桥粒数量明显减少。使用BMP4温敏水凝胶和BMP4滴眼液可以恢复半桥粒的稳定性和基底膜的完整性。结论:1、BMP4抑制角膜新生血管形成。2、BMP4在缝线诱导的CNV模型中可显著抑制VEGF-A的表达,显著抑制角膜CNV程度,新生血管长度变短,血管间连接减少,血管网状结构密度减轻。3、BMP4通过抑制尖端细胞的形成,破坏尖细胞的血管新生芽,打破尖、茎细胞的动态平衡,阻止了血管新生过程的有序进行从而抑制CNV。4、BMP4可以减轻角膜炎症反应,通过下调Raf1,抑制NOX-2介导的NETs形成进而抑制CNV。5、BMP4对角膜上皮有一定的修复作用,通过调控连接蛋白来实现。6、温敏凝胶包裹BMP4能够缓释BMP4药效,延长BMP4在眼表的停留时间,促进角膜更加快速的修复。