【摘 要】
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本论文的主要目的是建立用于mRNA-tagging的转基因C.elegans，希望通过利用mRNA-mggmg技术富集C.elegans感觉神经元中mRNA的方法，用获得的mRNA进行RDA(Representational differe
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本论文的主要目的是建立用于mRNA-tagging的转基因C.elegans，希望通过利用mRNA-mggmg技术富集C.elegans感觉神经元中mRNA的方法，用获得的mRNA进行RDA(Representational difference analysis of cDNA)，以解决直接用总RNA进行RDA构建减数文库高背景的问题。
本研究首先以C.elegans基因组DNA为模板，扩增得到mec-3基因启动子(mec-3p)；再以pPRSK9为模板，扩增得flag-pab-1融合基因，并分别将这两段基因克隆入载体pBluescript<Ⅱ>SK(+/-)，得到重组质粒pMec-3p-flag-pab-1。
利用基因枪打靶方法(microparticle bombardmem)将重组质粒pMec-3p-flag-pab-1和pDP＃MM016b(unc-119 rescuing质粒)共同转染成年的unc-119突变虫株(ed3)。挑取转化子进行单线虫的克隆化培养，并根据其F1代是否有unc线虫的出现而继续进行6代遗传筛选。筛选出的稳定虫株再与ed3回交5次，最后进行PCR鉴定flag-pab-1基因的存在，结果获得了纯合的转基因虫株，命名为y11(基因型：unc-119(-/-)；pDP＃MM016b(+/+)；pMec-3p-flag-pab-1(+/+)；ahr-1(+/+))；然后将ahr-1突变虫株ia03与ed3虫株杂交，通过遗传筛选和PCR筛选得到了缺失ahr-1和unc-119基因的双突变虫株，命名为y12，其基因型：unc-119(-/-)；ahr-1(-/-)；由yl1与yl2杂交用遗传筛选和PCR筛选得到了转染了pMec-3p-flag-pab-1和pDP＃MM016b质粒并缺失ahr-1基因的虫株，命名为yl3(基因型：unc-119(-/-)；pDP＃MM016b(+/+)；pMec-3p-flag-pab-1(+/+)；ahr-1(-/-))。
yl1与yl3转基因虫株的融合表达鉴定：针对flag-pab-1的mRNA序列设计引物，以yl1、yl3提取的总RNA为模板，用引物对flag-pab-1基因进行RT-PCR，结果在yl1与yl3都能扩增出相应大小的片段，表明外源的flag-pab-1融合基因能在转基因虫株中正常转录；用抗FLAG的单抗和异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG二抗进行免疫组化，结果显示在yl1与yl3虫株的ALML/R、FLPL/R、PVM、AVM等神经元细胞所在位置可见绿色荧光，表明融合基因flag-pab-1在转基因yl1与yl3虫株的这些感觉神经元中有表达。
最后，大量培养同期化的转基因yl1线虫，用超声破碎线虫，离心后得到的蛋白质上清与抗FLAG的单抗结合的琼脂珠孵育，进行免疫沉淀以富集与FLAG-PAB-1融合蛋白结合mRNA，对获得的mRNA进行线性扩增。结果：线性扩增后并未得到可以检测到的mRNA。本研究获得了可以用于后续mRNA-tagging研究的2个转基因虫株。
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