草鱼生长差异肠道菌群鉴定及短链脂肪酸受体基因功能研究

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草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要淡水养殖鱼类,生长性状是草鱼良种选育重要目标之一。肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸是调控草鱼生长的重要因素。本论文分析了草鱼不同肠道区域内含物和粘液的肠道菌群,比较了不同大小草鱼肠道菌群的组成与结构,探讨了短链脂肪酸对草鱼食欲的调控机制,研究了草鱼短链脂肪酸受体GPR41和GPR43的结构和功能,开发了草鱼GPR41中与生长性状相关的SNPs位点。主要研究结果如下:1.应用16S rRNA测序技术,对草鱼前、中、后肠内含物和粘液菌群进行比较。结果显示,草鱼肠道中变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroides)为主要的菌群。中肠菌群的α多样性指数显著高于前、后肠(P<0.05)。非度量多维尺度(NMDS)、置换多元方差(PERMANOVA)和非加权平均聚类(UPGMA)分析表明,草鱼后肠与前、中肠相比,菌群组成与结构存在显著差异(P<0.05),前(中)肠内含物与粘液之间的菌群组成与结构无显著性差异(P>0.05)。线性判别分析(LEf Se)结果表明,草鱼后肠中纤维素降解类菌群丰度显著高于前、中肠(P<0.05)。以上结果表明,草鱼后肠菌群的组成和结构与前、中肠显著不同。2.应用16S rRNA测序技术,对不同体重草鱼前、中、后肠内含物菌群进行比较。结果表明,低体重组(LWG)草鱼肠道菌群的α多样性指数高于高体重组(HWG)。HWG组的拟杆菌门与厚壁菌门的比值低于LWG组。主坐标分析(PCo A)和相似性分析(ANOSIM)结果表明,HWG组和LWG组的菌群组成与结构存在显著差异(P<0.05)。LEf Se分析显示,HWG组中代谢产生短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的菌群丰度显著高于LWG组(P<0.05)。系统发育分子生态学网络(p MENs)分析显示,HWG组菌群之间的相互作用更为复杂,表现为平均路径距离(GD)更短,平均聚类系数(avg CC)和平均度(avg K)更高。以上结果表明,草鱼肠道菌群的组成和结构与体重之间存在紧密的联系,肠道菌群代谢产物SCFAs可能是影响草鱼体重的关键因素。3.对草鱼注射SCFAs后肠道和脑组织食欲相关基因和肠道酶活性的变化进行研究。结果显示,对于肠道而言,PYY基因在注射后4h表达量显著降低,NPY基因在注射后4h表达量显著升高,CCK基因在注射后4-12h表达量显著降低,GPR41和GPR43基因在注射后4-12h表达量出现不同程度的升高;对于脑组织而言,NPY基因的表达量在注射后8-12h显著升高,CCK基因的表达量在注射后4-8h显著下降(P<0.05)。肠道中的淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性水平在注射后显著上升(P<0.05)。以上结果表明,草鱼注射SCFAs会影响肠道和脑组织中食欲调控因子的转录水平,提高肠道消化酶的活性。4.对草鱼短链脂肪酸受体GPR41和GPR43的cDNA全长,组织分布和信号传导机制进行研究。草鱼GPR41和GPR43 cDNA全长分别为1609 bp和2491 bp;组织表达谱显示,草鱼GPR41和GPR43在肠道和脾脏内转录水平较高。双荧光报告基因实验结果表明,SCFAs通过GPR41激活细胞Gαi/o-AC-c AMP通路,通过GPR43激活Gαi/o-AC-c AMP和PLC通路共同改变细胞内级联反应;钙离子检测结果表明,SCFAs激活GPR41以依赖Gαi/o蛋白的方式提高细胞质钙离子浓度,而对于GPR43介导钙离子浓度的提高不依赖Gαi/o蛋白。以上结果表明,草鱼GPR41和GPR43在SCFAs发挥生理功能的过程中起到重要的介导作用。5.对草鱼GPR41的SNPs位点与生长性状的相关性进行研究。草鱼GPR41中共筛选到8个SNPs位点,其中7个位点未显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。GPR41中共发现5种单倍型,其中Hap1(52.5%)所占比例最高。草鱼体质量和体长与突变位点1422 C>T的不同基因型存在显著相关性,其中杂合突变型(CT)个体的体质量与体长显著高于野生型(CC)个体(P<0.05)。以上结果表明,草鱼GPR41中1422 C>T位点与生长性状存在显著相关性,可作为草鱼生长性状改良的候选辅助分子标记。
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