急性肝衰竭是（Acute Liver Failure,ALF）是指多种原因引起的肝细胞大面积坏死或肝功能严重损害,相对于成人的ALF,儿童急性肝衰竭（pediatric acute liver failure,pALF）病因复杂,起病急,进展迅速,死亡率极高,目前仍是儿科重症医学面临的救治难题之一。目前采用的非生物型人工肝治疗,在急性肝衰竭的治疗中大大提高了ALF患者的存活率,但是目前对于具体的方式仍存在很大的争议。对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）是广泛应用于儿科临床解热镇痛药,过量摄入APAP可导致ALF。鱼藤酮（Rotenone）主要来源于Lonchocarpus和Derris物种的根和茎,是线粒体呼吸链（MRC）复合物I的强抑制物。本研究中,为了确定线粒体复合物I在APAP诱导的肝损伤中的作用,我们用线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮处理小鼠,然后暴露于APAP,发现鱼藤酮对APAP肝毒性具有显着的保护作用。通过抑制异常线粒体的活动和随后的线粒体氧化应激、炎症反应,保护APAP所致ALF。目的:1、构建多中心联合临床研究协作网,开展非生物型人工肝支持系统进行治疗小儿急性肝衰竭多中心研究,比较两种不同的血液净化方式对儿童急性肝功能衰竭的治疗作用。2、动物实验观察鱼藤酮对对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝功能衰竭的保护作用。3、探讨鱼藤酮对对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝功能衰竭的保护作用的分子机制。方法:1、构建多中心联合临床研究协作网,非生物型人工肝支持系统在儿童急性肝衰竭中前瞻性、多中心、随机临床对照研究联合包括北京市儿童医院在内的共27家国内三甲医院的PICU,构建多中心联合临床研究协作网,应用统一的入组诊断标准、随机数字法随机方案,将入选病例分成两组,A组:持续静-静脉血液透析滤过（CVVHDF）+血浆置换（TPE）+标准内科治疗的方案（SMT）;B组:必要时CVVHDF+TPE+SMT的治疗方案作比较。进行非生物型人工肝支持系统在儿童急性肝衰竭中前瞻性、多中心、随机临床对照研究,比较两种不同强度的血液净化治疗对儿童急性肝功能衰竭的治疗作用。2、动物实验,观察鱼藤酮对对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝功能衰竭的保护作用（1）探索合适的对乙酰氨基酚剂量,构建稳定的BALB\c小鼠对乙酰氨基酚中毒致急性肝衰竭动物模型。（2）鱼藤酮饮食喂养小鼠,与正常饮食组小鼠对比,通过ELISA方法测定血清肝功能指标,及病理观察肝损伤情况,观察治疗剂量鱼藤酮对小鼠肝脏的影响。（3）将7-8周龄BALB\c小鼠随机分入A组:对照组（Vehicle）,B组:对乙酰氨基酚肝衰竭（APAP）,C组:鱼藤酮预处理+APAP肝衰竭（APAP+Rot）。ELISA方法测定急性肝损伤指标,及病理观察肝损伤情况。3、探讨鱼藤酮对对乙酰氨基酚所致小鼠急性肝功能衰竭的保护作用的分子机制。（1）qRT-PCR法测定三组动物肝脏mtDNA水平;（2）Western-Blot法及qRT-PCR法测定肝脏组织氧化应激指标,观察鱼藤酮治疗减轻APAP所致氧化应激反应;（3）qRT-PCR法测定肝脏组织内炎症反应指标,观察鱼藤酮治疗减轻APAP所致急性炎症反应;（4）Western-Blot法及qRT-PCR NADPH氧化酶4表达的影响;（5）观察线粒体复合物III嘧菌酯（Azoxystrobin,AZOX）处理对APAP诱导的小鼠肝毒性的干预作用。结果1.本研究最终纳入国内15家三级甲等医院PICU病例共188例,严重脓毒症是儿童急性肝损伤的最主要原因,药物性肝损害中主要致病因素是对乙酰氨基酚,占所有病例的12.2%。两种不同血液净化方式的人工肝治疗患者比较,28天存活率分别为58.33%、55.32%,90天存活率分别为52.08%、46.81%,无显著统计学差异。生化指标比较,人工肝开始治疗后第1天两组相比,持续治疗组ALT水平明显下降,第5天,两组间ALT、AST水平相比,持续治疗组均显著下降。治疗的第5、7天,持续治疗组较必要时CRRT治疗组血清胆红素水平显著下降。两组间凝血功能改善无显著差异。两组间血常规的检测发现,持续血液净化治疗组Hb及PLT水平均显著下降,两组间比较有显著统计学差异。A、B两组患者治疗过程中进行机械通气时间及ICU滞留时间无显著统计学差异,小儿危重病例评分（PCIS）及Glasgow评分（GCS）比较无差异。对两组患者治疗过程中进行住院总费用和人工肝治疗费用的比较,持续CRRT组ICU住院总费用显著上升,人工肝治疗费用显著增加,有显著统计学差异。2.鱼藤酮毒性实验发现,250PPM浓度鱼藤酮对于小鼠肝脏病理及血生化ALT、AST无显著影响。通过腹腔注射300mg/kg APAP溶液,成功建立稳定的APAP肝损伤小鼠模型。APAP给药24小时后观察到APAP治疗导致肝脏中心小叶坏死,鱼藤酮预处理显著减弱细胞坏死。生化检测Vehicle组、APAP组及APAP+Rotenone组血浆ALT分别为:82.86±68.49 IU/L,17825±7731 IU/L,2125±3191 IU/L;三组AST的水平分别为:230.0±348.1IU/L,11950±6240 IU/L,1282±1906 IU/L。三组GSH的水平分别为8.157±1.211μmol/mg,4.42±1.386μmol/mg,7.257±1.141μmol/mg。鱼藤酮预处理显著改善APAP所致ALT、AST升高,显著抑制GSH消耗。3.qRT-PCR法检测Vehicle组、APAP组及APAP+Rotenone组肝脏组织mt DAN拷贝数和13个线粒体基因的表达,三组mtDNA的表达水平分别为1.0±0.256,0.68±0.131,1.053±0.261,鱼藤酮显著改善APAP所致肝细胞的mtDNA下调。APAP给药导致肝脏组织SOD1和SOD2在mRNA水平上的显著降低,及SOD2蛋白表达显著下降,鱼藤酮处理可减少APAP所致SOD2下调。肝脏中增加的氧化应激标记物MDA也可被鱼藤酮预处理阻断。APAP诱导的IL-6,IL-1β和MCP-1的炎性细胞因子的上调,而通过鱼藤酮预处理,可阻断这一过程。APAP显著下调小鼠肝脏中NOX4的蛋白质和mRNA水平,通过鱼藤酮处理显著逆转。与单用APAP治疗相似,AZOX预处理组同样出现大片肝细胞坏死,增高的ALT和AST血浆水平未被AZOX阻断。结论1.儿童急性肝功能衰竭仍是PICU的重要挑战。相对于必要时进行CRRT+TPE的人工肝模式,更多的血液净化治疗,虽然能够更显著地改善患者肝功能,但是并不能更加显著地改善患者的最终存活率,未缩短患者的住院时间和依赖呼吸支持的时间,反而增加了患者对于输血的需要,显著增加了患者的住院费用。2.线粒体复合物I鱼藤酮可改善APAP所致小鼠急性肝损伤以及线粒体异常。3.鱼藤酮处理,通过阻断APAP所致的肝脏氧化应激,下调炎症反应,上调NOX4的表达,保护APAP所致小鼠急性肝损伤,线粒体复合物III嘧菌酯处理无此作用。