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第一部分大鼠骨髓间充质干细胞（RMSCs）的分离纯化培养及鉴定【目的】体外分离纯化、培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（Rat bone marrow mesenchymal stem cells,RMSCs）,为下一步实验和研究提供材料。【材料与方法】1.RMSCs的分离纯化培养从5-6周龄的Sprague Dawley（SD）大鼠后腿骨中提取大鼠骨髓,用D-Hanks液稀释以充分掺入,800 rpm/min离心5分钟;弃去上清液,用DMEM轻柔地将细胞分散成单细胞悬浮液。将此悬浮液缓慢加入密度淋巴细胞分离培养基（ρ:1.077g/cm-3）的表面,并以3000 rpm/min离心20分钟,取出单核细胞层并用D-Hanks液洗涤两次,置入含有20%胎牛血清（FBS）的DMEM培养瓶中进一步培养。2.RMSCs的鉴定通过台盼蓝实验检测细胞存活率。将培养瓶放置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养,48小时后更换培养基,弃去未贴壁的细胞,并且每天在倒置相差显微镜下观察细胞状态。待细胞融合长满培养瓶底部时,用0.25%胰蛋白酶消化并传代。通过流式细胞术及体外定向诱导分化鉴定第三代RMSCs细胞。【结果】1.形态观察:接种后,RMSCs分布于培养瓶底部,呈圆形,细胞质明亮,折射性好。单个细胞在24小时后开始粘附于壁,增大并且细胞质向外延伸,类似于成纤维细胞,48小时后,贴壁细胞的形态为梭形,三角形,扇形及圆形。5天后,细胞形成分散的集落。2.流式细胞检测:流式细胞检测结果显示CD29和CD44阳性率分别达到95.34%、85.12%,而CD34和CD45阴性率分别为4.69%、5.12%。MTT生长曲线显示细胞增殖较快,生长状况稳定。3.体外定向诱导分化:诱导成脂实验中,经鉴定细胞内有脂滴集聚,证明定向成脂较好;诱导成骨细胞,采用茜素红染色,观察到细胞内有较多的钙结节,证明定向成骨较好;诱导软骨细胞,经Ⅱ型胶原-FITC染色测定,在绿色荧光显微镜下细胞呈现绿色,呈阳性表达软骨细胞特性。【结论】联合运用密度梯度离心和贴壁筛选法分离纯化培养RMSCs,可获得纯度高、增殖速度快、生物学特征稳定的RMSCs,为下一步实验提供理想的种子细胞。第二部分纳米阳离子脂质体的制备及Sox9基因转染【目的】探讨通过纳米阳离子脂质体将Sox9基因转入RMSCs并实现其表达的可行性。【材料与方法】1.阳离子脂质体的制备采用薄膜分散法制备阳离子脂质体。简而言之,准确称取350mg 2,3-二油酰基-丙基（2,3-Dioleoyloxy-propyl）-trimethylammonium,DOTAP)溶解于1ml氯仿中,并与370mg二油酰基卵磷脂（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC）混合。用氯仿将混合物总体积稀释至10ml并涡旋10分钟。使用旋转蒸发器在50℃下蒸发溶剂,使DOTAP和DOPC以薄膜分散在管壁上。干燥后继续蒸发1小时以除去残余溶剂。将脂质膜制成粉末并在剧烈搅拌下溶解于4ml水中以形成阳离子脂质体。通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）和动态激光散射（Dynamic Light Scattering,DLS）对该制剂进行进一步表征。取一定量的阳离子脂质体,加水稀释定容至10 m L,稀释液加入样品池中进行测定,以微粒个数为基准,测定粒径和Zeta电位。每个样品测定6次,取平均值。取一定量的阳离子脂质体,加水稀释定容至10 m L,取稀释液适量至小烧杯中,静置10 min,加3%磷钨酸负染,吸取负染液滴至铜网上,滤纸吸去多余染色液,静置30 min,使微粒沉积在铜网上,利用TEM观察粒径大小和形态。所有测量均在25℃下进行。2.阳离子脂质体介导转录因子Sox9的RMSCs诱导分化研究采用体外培养的第三代RMSCs进行后续实验。首先将Sox9质粒与阳离子脂质体溶液（不含FBS）在室温下充分混合,静置20分钟。然后将此混合物添加到含有RMSCs的6孔板中,并在37℃、5%CO2培养箱中培养。4小时后换完全培养基培养,继续培养做后续检测与鉴定。其中,细胞转染分为3组,（1）实验组:阳离子脂质体载Sox9质粒的转染组;（2）对照组1:仅含等量的阳离子脂质体;（3）对照组2:市售Lipofectamine 2000载Sox9质粒的转染组。培养6天后,用免疫化学法鉴定细胞。3.检测Sox9基因表达对于上述实验,接着连续培养7天后,收集细胞上清,采用酶联免疫吸附法（ELISA实验）测定RMSCs中Sox 9的表达量及持续时间。使用SPSS统计软件进行统计分析。【结果】1.阳离子脂质体的鉴定阳离子脂质体的平均粒径为85.76±3.48nm,zeta电位为15.76±2.1m V,说明该阳离子脂质体具有纳米颗粒的单分散性质。阳离子脂质体的TEM与具有小于100nm的小尺寸DLS具相同的结果,具有预期的均匀类球形特点。2.RMSCs向软骨细胞分化的形态变化用Sox9基因转染RMSCs7天后,细胞突起变长,细胞体变宽,折射率增加。通过MTT法描述生长曲线,结果显示Sox9基因转染后细胞的增殖速率较快,生长状态良好,可见毒性较小。3.ELISA检测RMSCs内Sox9基因的表达通过ELISA法检测Sox9蛋白的表达量,与市售脂质体相比,阳离子脂质体转染效率较高,且保证质粒浓度为100ng/孔时达到最佳转染浓度。【结论】运用薄膜分散法制备的纳米阳离子脂质体,可以以Sox9 c DNA基因为靶点,成功转染RMSCs并具有软骨样表型,且Sox9基因表达稳定。第三部分温敏型水凝胶支架的构建【目的】体外构建具有温度敏感性的壳聚糖水凝胶支架。【材料与方法】将壳聚糖加入到0.1mol/L盐酸溶液中,形成最终浓度为2%（w/v）的溶液A,配制体积分数为50%（w/v）的β-甘油磷酸钠溶液。然后合并两种溶液并以不同比例（v/v）混合,将制备一系列不同比例的水凝胶保持在4℃液体状态,并在37℃下测试温度敏感性。采用SEM观察其形貌特征,并进行力学性能测试、溶胀性能测试、体外释放能力、体外降解程度、体外增殖等实验。【结果】1.在37℃下观察不同比例壳聚糖水凝胶的成胶形成过程。结果显示,壳聚糖和β-甘油磷酸钠的比例不同,其成胶时间不同,随着β-甘油磷酸钠量的递增,成胶时间从30分钟下降至3分钟。2.SEM观察:凝胶支架孔结构均匀致密,一定的孔隙率（85%）很好的模拟了细胞生长的外基质环境。3.力学压缩测试:随着β-甘油磷酸钠比例的增加,水凝胶支架力学强度也随之增加。4.凝胶溶胀度测试:随着β-甘油磷酸钠的增加,水凝胶支架溶胀度呈现降低的趋势。5.凝胶释放、体外降解测试:实验结果显示,壳聚糖和β-甘油磷酸钠的比例为5:1时,水凝胶支架累计释放量最小,体外降解的最少。6.凝胶体外增殖测试:水凝胶浓度越低,细胞增殖率越高。【结论】使用壳聚糖与β-甘油磷酸钠可以成功制备不同比例的温敏型水凝胶生物支架,其比例为5:1时水凝胶支架最为稳定,更加符合组织工程支架的要求。第四部分应用纳米基因工程转染Sox9基因的RMSCs与温敏型水凝胶支架构建组织工程软骨【目的】应用纳米基因工程转染Sox9基因的RMSCs与温敏型水凝胶支架在裸鼠体内构建组织工程软骨。【材料与方法】将转染2周的RMSCs细胞,与温敏壳聚糖水凝胶混合并皮下注射到裸鼠背部。将裸鼠体内实验分为4组:未转染Sox9基因的RMSCs-壳聚糖-水凝胶复合体（A组）,转染Sox9基因的RMSCs壳聚糖-水凝胶复合体（B组）,未转染Sox9基因的RMSCs（C组）和壳聚糖水凝胶（D组）。SPF级环境下喂养4周后,观察裸鼠皮下注射部位组织以观察软骨的形成,采用苏木精-伊红染色（HE）,番红O染色,胶原II、Ⅸ进行免疫组织化学（IHC）染色鉴定,采用Western-Blot对形成的软骨进行进一步鉴定。【结果】在饲养4周后处死裸鼠并解剖注射部位。在A组和B组中发现相似的薄片样组织结构,B组外观类似半透明软骨,A组外观类似纤维组织;而C组和D组未见类似组织结构。HE染色显示:A组组织无完整软骨细胞形态,而B组组织中可见细胞的聚集,类似于软骨细胞表达;Safranin O染色显示:A组无正常软骨组织,B组细胞形态与排列与正常软骨组织无明显差异;II、Ⅸ型胶原免疫组织化学染色显示:A组组织未见明显软骨细胞形成,B组组织中可见软骨细胞形成,脱蜡后细胞质呈棕黄色,细胞核呈空泡状。【结论】应用纳米基因工程转染Sox9基因的RMSCs与温敏型水凝胶支架在裸鼠体内成功构建了组织工程软骨,且工程支架可以被分解吸收,为软骨修复提供了一种新方法。