研究目的:课题组前期研究发现,人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stem cell,HAMSC）能够通过促进血管新生,进而促进新骨生成,修复骨缺损,但其中的作用机制尚不明确。基因芯片检测结果提示:HAMSC在促进血管新生过程中长链非编码RNA（Long noncoding RNAs,LncRNA）H19表达明显增高。因此,本文通过研究H19是否在HAMSC促进血管新生过程中发挥重要作用及其作用机制,揭示HAMSC作为种子细胞促进血管新生进而增强新骨形成的理论基础,同时为我们进一步修饰HAMSC,更好地将其作为组织工程化骨的种子细胞提供实验依据。研究方法:为了明确H19是否在HAMSC促进血管新生过程中发挥重要作用,我们构建了H19稳定低表达的HAMSC（HAMSC-siH19）,通过体内、体外分别与脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）三维共培养,观察在血管新生的早期,干扰H19后的HAMSC促进HUVEC出芽和成管能力的改变。通过CCK8和transwell小室实验,观察下调H19后,HAMSC分泌的条件培养基促HUVEC增殖、迁移能力的改变;通过人成血管相关因子蛋白芯片分析及ELISA实验,检测干扰H19后HAMSC旁分泌的细胞因子表达量的改变;通过RT-PCR、Western Blot检测干扰H19后HAMSC本身表达的成血管相关因子RNA、蛋白水平的改变。进一步的机制研究中,我们进行CHIP、RIP实验以验证H19是否在HAMSC中通过绑定甲基化转移酶EZH2,募集甲基结合到抑制血管生成相关因子的基因启动子区域,从而抑制其表达。实验结果:构建了H19稳定低表达的HAMSC,与HUVEC三维共培养,发现:相比对照共培养组,在体外实验中,HAMSC-siH19共培养组中HUVEC平均出芽长度减小;裸鼠皮下培养7天后观察共培养移植物,发现HAMSC-siH19共培养组血管新生能力减弱。与对照组条件培养基相比,HAMSC-si H19条件培养基对HUVEC增殖和迁移能力产生抑制。蛋白芯片分析及ELISA检测显示:干扰H19后,HAMSC分泌的促进血管生成相关因子血小板生长因子（Platelet-derived growth factor,PDGF）、血管生成素（Angiogenin,ANG）等浓度降低,而抑制成血管因子血小板因子4（Platelet Factor 4,PF4）、血管生成抑制因子（Vasohibin1,VASH1）等浓度升高。RT-PCR、Western Blot检测干扰H19后HAMSC本身表达的成血管指标下调,而抑制血管生成指标升高。CHIP和RIP实验证明:在HAMSC中血管生成抑制因子VASH1的表达受到了甲基化转移酶EZH2介导的组蛋白甲基化修饰调控,而H19可通过绑定EZH2,增强其表观遗传调控作用。在干扰H19后,减少了EZH2与VASH1启动子区域的结合,降低了VASH1启动子区域甲基化程度,从而调控VASH1表达上调。结论:在体内外共培养模型中,证明了在血管新生早期,干扰H19后的HAMSC促进血管新生能力明显减弱。干扰H19后,HAMSC分泌的促血管生成的相关因子ANG、PDGF等降低,而抑制血管生成的相关因子VASH1、PF4等有所升高;同时干扰H19后HAMSC本身表达的成血管指标下调,而抑制血管生成指标升高。机制研究发现H19在HAMSC中通过绑定甲基化转移酶EZH2,募集甲基结合到VASH1的基因启动子区域,抑制VASH1表达,进而减少HAMSC细胞旁分泌VASH1,促进血管新生。