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第一部分 经皮穴位电刺激对放疗小鼠卵巢功能保护作用目的:经皮穴位电刺激（transcutaneous electrical acupoint stimulation,TEAS）是一种将自粘性电极片放在皮肤特定穴位表面,通过输出一定幅度的电流经神经-体液作用影响组织和器官功能的物理疗法。TEAS关元穴已被广泛应用于卵巢功能减退及早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency,POI）治疗,但具体机制尚不明确。本研究拟以放疗小鼠为模型,观察放疗对小鼠卵巢功能的影响,探讨TEAS关元穴对放疗小鼠卵巢功能的保护作用。方法:选取60只8周龄,SPF级C57BL6雌性小鼠,随机分为6组,每组10只,分别为:①对照组+模拟TEAS治疗（control-）,②对照组+TEAS治疗（control+）,③实验组放疗后2天+模拟TEAS治疗（IR 2D-）,④实验组放疗后2天+TEAS治疗（IR 2D+）,⑤实验组放疗后1周+模拟TEAS治疗（IR 1W-）,⑥实验组放疗后1周+TEAS治疗（IR 1W+）。全身单次4 GyX射线辐照处理作为实验组,全身单次0 Gy X射线辐照处理作为对照组。TEAS选用参数为频率2 Hz,脉宽200 μs,电流1 mA,每天一次,一次30 min,持续2周,每周连续6天。模拟TEAS治疗为仅给予穴位敷贴电极片,无电刺激。观察治疗前后小鼠动情周期,治疗结束后分别收集各组小鼠血清及卵巢组织。应用酶联免疫吸附法（ELISA）法检测小鼠血清抗苗氏勒管激素（anti-mullerian hormone,AMH）水平,卵巢组织石蜡切片行HE染色观察卵巢组织形态学改变,并计数各级卵泡数。结果:与control-组相比,IR 2D-及IR 1W-组小鼠动情后期及动情间期延长,血清 AMH 水平明显下降（IR2D-vs.control-:3.03±0.27 ng/mlvs.5.17±0.44ng/ml,P=0.014;IR 1W-vs.control-:2.30±0.18 ng/ml vs.5.17±0.44 ng/ml,P=0.003）,两组卵巢体积及湿重均显著降低（P<0.001）。与control-相比,IR2D-组小鼠原始卵泡数目减少约 87.15%（74.00± 14.21 vs.576.00±42.79,P<0.001）、初级卵泡数量减少 86.28%（47.00±5.12 vs.342.50±31.81,P<0.001）、次级卵泡数量减少 60.58%（16.40±2.39 vs.41.60±6.76,P=0.002）,但窦卵泡数目无明显改变（P=0.637）,IR 1W-组小鼠各级卵泡计数均进一步显著下降。HE染色提示IR 2D-组小鼠卵巢组织内卵母细胞皱缩,闭锁卵泡增多,间质增生,IR 1W-组小鼠卵巢组织损伤更严重,卵巢皮质变薄,闭锁卵泡增多,残留较多黄体组织,间质增生,间质纤维化,次级卵泡及窦卵泡内颗粒细胞分散并失去完整性。与IR 2D-相比,放疗后2天予以TEAS治疗（IR 2D+）小鼠动情周期恢复正常,AMH水平明显升高（4.13±0.18 ng/ml vs.3.03±0.27 ng/ml,P=0.028）,原始卵泡损失数量明显减少（189.50±33.64 vs.74.00±10.21,P=0.006）,但初级卵泡（P=0.056）、次级卵泡（P=0.169）及窦卵泡（P=0.522）的数量变化不明显。放疗后1周予以TEAS治疗（IR 1W+）不能显著改善小鼠动情周期、AMH水平、卵巢形态学及减轻放疗对各级卵泡计数的损伤（P>0.05）。结论:全身单次4Gy X线辐照可造成小鼠动情周期紊乱,AMH水平降低,且对卵巢形态学及各级卵泡计数产生显著的损伤作用;辐照后2天即予以TEAS治疗可减轻由放疗引起的小鼠卵巢功能及原始卵泡损伤。第二部分经皮穴位电刺激保护放疗小鼠卵巢功能的机制研究目的:辐照可造成小鼠动情周期紊乱,对卵巢形态学及各级卵泡计数产生显著的损伤作用。予以TEAS治疗对由放疗引起的小鼠卵巢功能损伤产生一定的恢复作用。但具体机制尚不明确。PTEN/Akt/FOX03a信号通路是维持原始卵泡生存、激活和凋亡平衡的重要分子机制之一,亦参与调控细胞氧化应激反应。X线辐照会引起组织细胞氧化应激的发生,造成细胞内大量产生活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）,过量的ROS及氧化反应动态失衡会损伤线粒体功能,导致颗粒细胞及卵泡凋亡。本研宄拟在第一部分研究基础上,探讨TEAS对放疗小鼠卵巢功能保护的可能机制。方法:选取40只8周龄,SPF级C57BL6雌性小鼠,随机分为4组,每组10只,分别为:①对照组+模拟TEAS治疗（control-）,②对照组+TEAS治疗（control）,③实验组放疗后2天+模拟TEAS治疗（IR 2D-）,④实验组放疗后2天+TEAS治疗（IR 2D+）。全身单次4 Gy X射线辐照处理作为实验组,全身单次0 Gy X射线辐照处理作为对照组。TEAS选用参数为频率2 Hz,脉宽200|xs,电流1mA,每天一次,一次30 min,持续2周,每周连续6天。模拟TEAS组为仅给予穴位敷贴电极片,无电刺激。治疗结束后收集各组小鼠卵巢组织。应用Western blot方法检测各组卵巢组织PTEN、Akt、F0X03a、GSK3p、ERK1/2磷酸化蛋白和总蛋白的表达含量,免疫荧光方法检测F0X03a和p-F0X03a在原始卵泡中的表达及定位。此外,采用ELISA方法测定卵巢组织勾衆中的超氧化物歧化酶2（SuperoxideDismutase 2,SOD2）,比色法谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）以及采用硫代巴比妥酸（TBA）反应法测定丙二醛（malondi-aldehyde,MDA）水平变化。结果:IR 2D-组与对照组相比,小鼠卵巢组织PTEN（P<0.001）,Akt（P<0.001）,ERK（P0.001）,GSK3P（P=0.042）及FOX03a（P=0.049）磷酸化蛋白相对表达水平均显著增加。同时,放疗可引起小鼠卵巢组织MDA（22.55±1.16nmol/mgvs.10.10±1.18nmol/mg,P=0.002）含量升高,SOD2（2065.37±173.21pg/ml vs.3022.85±178.31 pg/ml,P=0.018）、GSH-Px（85.41±13.03 u/mg vs.185.58±5.37u/mg,P=0.002）含量降低,诱导小鼠卵巢发生组织氧化应激反应。放疗后2天予以TEAS治疗（IR2D+）可显著降低PTEN（P=0.023）,Akt（P=0.010）,ERK（P=0.016）,GSK3p（P=0.012）及F0X03a（P=0.019）磷酸化蛋白水平。通过免疫荧光检测发现,IR 2D-组FOX03a磷酸化蛋白在原始卵泡中表达明显增加,而予以TEAS治疗后（IR2D+）可显著抑制F0X03a憐酸化水平及由细胞核向胞质转运效应。并且TEAS治疗可显著抑制卵巢组织的MDA含量（18.38±0.78 nmol/mg vs.22.55±1.16 mnol/mg,P=0.041）,升高SOD2（2744.24±169.74pg/ml vs.2065.37±173.21 pg/ml,P=0.048）及GSH-Px（150.37±12.69 vs.85.41士13.03,P=0.023）活性。结论:全身单次4Gy X线辐照后2天明显激活小鼠卵巢组织PTEN/PI3K/F0X03a信号通路,增加原始卵泡F0X03a磷酸化蛋白水平,促进其出核,失去转录活性,激活原始卵泡。TEAS治疗可拮抗放疗对PTEN/PI3K/F0X03a信号通路激活作用,降低F0X03a磷酸化蛋白水平,抑制F0X03a由细胞核向胞质转运,减缓原始卵泡过度激活。同时,TEAS可抑制放疗引起的卵巢组织氧化应激的发生,通过降低小鼠卵巢局部脂质氧化产物MDA生成,并升高抗氧化酶SOD2及GSH-Px含量增强卵巢组织的抗氧化能力。综上所述,TEAS通过拮抗PTEN/PI3K/F0X03a信号通路激活,降低F0X03a磷酸化水平,进而抑制原始卵泡过度激活,以及增强卵巢组织抗氧化能力,可能是TEAS保护放疗小鼠卵巢功能的机制之一。