论文部分内容阅读
脂肪肝是现代畜牧业高产动物常发的代谢性疾病,降低生产和繁殖性能,损害动物福利,带来巨大的经济损失,目前尚无有效的特异性营养调控物质。红景天苷(Salidroside,SAL)是植物提取物,高效低毒,具有多种药理活性。本课题组前期研究发现围产期奶牛脂肪肝发病率高达58.6%。奶牛属大型动物进行脂肪肝相关研究时,肝脏活体采样存在一定难度且影响动物生产,屠宰取样成本高。模式动物小鼠已经被广泛应用于肝脏生理或病理方面的机制研究,因此本试验通过细胞试验和小鼠试验探究红景天苷对脂肪肝模型的脂质沉积和炎症的调控作用。应用转录组学技术,对红景天苷的作用机制进行分析,应用基因沉默技术和特异性抑制剂,对筛选的通路进行体外和体内双重的验证试验。以期为动物生产中奶牛脂肪肝的防控提供理论依据和新思路。第一部分红景天苷对脂质沉积和炎症反应的调控作用细胞试验:棕榈酸/油酸(PO)刺激小鼠原代肝细胞12 h模拟脂肪肝进程中脂质代谢物诱导的肝细胞脂质沉积和炎症反应。细胞分为4种处理组:空白对照组,模型组(仅PO刺激),SAL-L组(PO+SAL低剂量50μmol/L)和SAL-H组(PO+SAL高剂量100μmol/L)。各组进行了尼罗红染色,模型组和SAL-H组进行了转录组测序分析。主要结果如下:(1)尼罗红染色结果显示,与对照组相比,模型组桔红色脂滴明显增多。与模型组相比,SAL-L组和SAL-H组脂滴积累明显减少,且呈现剂量依赖性。(2)转录组结果显示,与模型组相比,SAL-H组细胞内脂质代谢和炎症相关信号转导及相关分子的表达呈下调状态。小鼠试验:40只SPF级、8~10周龄、体重22g~25g的C57BL6/J雄性小鼠分为4组:NC-Vehicle组(对照组)、HFHC-Vehicle(模型组)、HFHC-Sal-L组(HFHC+SAL 100 mg/kg/d)和HFHC-Sal-H组(HFHC+SAL 200 mg/kg/d)。小鼠饲喂高脂/高胆固醇(HFHC)饲料16周建立脂肪肝炎模型,对照组饲喂正常饲粮。第9周开始,HFHC-Sal-L组和HFHC-Sal-H组小鼠饲喂HFHC日粮的同时每天灌胃相应剂量的红景天苷,连续灌胃8周。试验结果如下:(1)与NC-Vehicle组相比,HFHC-Vehicle组小鼠的空腹体重(BW)、白色脂肪重(WW)和白脂重/体重显著增加(WW/BW)(P<0.01)。与HFHC-Vehicle组相比,HFHC-Sal-L组和HFHC-Sal-H组小鼠的BW、WW和WW/BW都显著降低(P<0.01)。(2)H&E和油红O染色显示,红景天苷给药减少了HFHC饮食诱导的小鼠肝脏细胞质脂肪空泡、球囊性变性和脂滴的积累,且呈现剂量依赖性。与NC-Vehicle组相比,HFHC-Vehicle组小鼠的肝重、肝体比、肝脏甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量显著增加(P<0.01)。与HFHC-Vehicle组相比,HFHC-Sal-L组和HFHC-Sal-H组小鼠的肝重、肝体比、TG和TC都显著降低(P<0.01)。(3)与HFHC-Vehicle组相比,HFHC-Sal-L组和HFHC-Sal-H组中脂代谢相关基因的m RNA(CD36、FABP1、FASN、PPARγ、SCD1和SREBP-1)和蛋白(FASN和PPARγ)表达水平都显著降低(P<0.01)。(4)免疫组化切片中,红景天苷给药减少了HFHC饮食诱导的肝组织中Cd11b阳性细胞的浸润。与HFHC-Vehicle组相比,HFHC-Sal-L组和HFHC-Sal-H组中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和趋化因子(CCL2和CXCL10)的m RNA表达水平显著降低(P<0.01),IKKβ和p65蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01),IKBα蛋白表达水平显著上升(P<0.01)。(5)转录组结果显示,与HFHC-Vehicle组相比,HFHC-Sal-H组小鼠肝脏中脂质代谢和炎症相关信号转导及相关分子的表达呈下调状态。第二部分红景天苷调控脂质沉积和炎症反应的机制研究机制探索:为了阐明红景天苷缓解脂肪沉积和炎症反应的具体机制,将红景天苷作用于PO刺激的原代肝细胞和HFHC饮食小鼠肝组织的转录组数据联合分析,并通过Western Blot检测筛选通路的蛋白表达。结果如下:(1)KEGG富集分析结果显示,红景天苷在细胞和小鼠中的调控作用分别涉及到多种信号通路,AMPK信号通路是共有通路中变化最显著的通路。(2)Western Blot结果证明红景天苷在PO刺激的肝细胞和HFHC饮食小鼠肝脏中显著提高了AMPKα的磷酸化水平(P<0.01),促进了AMPK信号通路的激活。细胞验证:为验证红景天苷通过AMPK信号缓解脂肪肝体外模型的脂质沉积和炎症,在PO刺激的原代肝细胞中进行AMPK基因沉默和红景天苷处理,分为:Adsh RNA-DMSO组(PO刺激)、Adsh RNA-Sal组(PO+SAL)、Adsh AMPK-DMSO组(PO+AMPK沉默)和Adsh AMPK-SAL组(PO+AMPK沉默+SAL),结果如下:(1)尼罗红染色结果显示,与Adsh RNA-DMSO组相比,Adsh RNA-Sal组中PO刺激下桔红色脂滴明显减少,而Adsh AMPK-Sal组与Adsh AMPK-DMSO组的桔红色脂滴相当。(2)与Adsh RNA-DMSO组相比,Adsh RNA-Sal组的肝细胞TG含量、脂肪酸合成(SCD1、ACC和FASN)和炎症(IL-1β、IL-6和TNF-α)相关基因的m RNA表达水平显著降低(P<0.01),而Adsh AMPK-Sal组与Adsh AMPK-DMSO组的上述指标没有显著性差异(P>0.05)。动物验证:为验证红景天苷通过AMPK缓解小鼠脂肪肝模型的脂质沉积和炎症,给HFHC饮食小鼠饲喂化合物C(CC)抑制AMPK的表达,以及红景天苷灌胃给药。40只SPF级、8~10周龄、体重22 g~25 g的C57BL6/J雄性小鼠分为:PBS-Vehicle组(仅HFHC饮食)、PBS-Sal-H组(HFHC+SAL 200 mg/kg/d)、CC-Vehicle组(HFHC+CC)和CC-Sal-H组(HFHC+CC+SAL 200 mg/kg/d)。试验结果如下:(1)H&E、油红O染色和免疫组化结果所示,与PBS-Vehicle组相比,PBS-Sal-H组中肝脏细胞质脂肪空泡、球囊性变性、脂滴积累和Cd11b阳性细胞的浸润明显减少,而CC-Sal-H组和CC-Vehicle组的染色结果相当。(2)与PBS-Vehicle相比,PBS-Sal-H组小鼠的肝重、肝体比、肝脏TG和TC含量、肝组织中与脂肪酸摄取(CD36、FASN、PPARγ和SREBP-1)和炎症(IL-1β、IL-6和TNF-α)相关基因的m RNA水平显著降低(P<0.01),而CC-Vehicle组和CC-Sal-H组的上述指标没有差异(P>0.05)。综上所述,红景天苷通过增强AMPKα的磷酸化水平,促进AMPK信号通路的激活,缓解脂肪肝的体内外模型的脂质沉积和炎症反应。