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端粒酶(Telomerase)是一种核蛋白逆转录酶,它可以利用自身的端粒酶RNA为模板,在端粒DNA的3’端合成端粒重复序列。研究表明,85%以上的肿瘤细胞中端粒酶表达水平均上调,然而在正常体细胞中通常检测不到端粒酶活性。因此,端粒酶被视为一种重要的肿瘤标志物。端粒酶RNA是构成端粒酶的重要组成部分,其表达水平和端粒酶活性直接相关。因此,端粒酶RNA也被看作是一种肿瘤标志物。目前,研究者们已经建立了多种检测端粒酶活性的方法,能够灵敏、可靠检测端粒酶活性。但大多数方法是检测从肿瘤细胞中提取的端粒酶的活性,这并不能直接反映复杂生理环境中端粒酶的活性。端粒酶的提取和储存过程也可能会对端粒酶活性有影响。因而,在细胞内进行原位成像,可以更为可靠地研究复杂生理环境中端粒酶和端粒酶RNA的表达水平。这对于在细胞水平上对肿瘤标志物可靠分析,实现疾病的早期诊断具有重要意义。本文基于链替代信号放大和比率型荧光共振能量转移技术,开展了细胞内端粒酶RNA和端粒酶活性检测的荧光法研究。主要研究内容如下:一、灵敏检测细胞内端粒酶RNA的比率型荧光法研究基于链替代循环信号放大,建立了一种检测端粒酶RNA(hTR)的比率型荧光共振能量转移法。以二氧化锰纳米片作为载体,运送羧基荧光素标记的发夹DNA探针(FAM-H1)和四甲基罗丹明标记的发夹DNA探针(TAMRA-H2)进入细胞。细胞内的谷胱甘肽分解二氧化锰纳米片,从而释放出DNA探针。当hTR存在时,hTR与FAM-H1反应,打开FAM-H1的发夹结构,使得FAM-H1与TAMRA-H2之间发生链替代反应,将hTR替代下来继续与下一个FAM-H1反应。这样的循环链替代反应可不断形成FAM-H1/TAMRA-H2杂交双链,使得FAM和TAMRA距离相互靠近,发生荧光共振能量转移现象,从而实现信号放大。细胞外荧光测定表明,荧光比率变化与hTR浓度在0.1 nM至5 nM范围内呈良好的线性关系,检出限为0.077 nM。荧光成像分析表明,该方法能够可靠反映细胞内hTR的表达水平,可区分肿瘤细胞和正常细胞内hTR表达水平的差异。因此,该方法是一种简便、灵敏、可靠检测细胞内hTR的比率型荧光法。二、灵敏检测细胞内端粒酶活性的比率型荧光法研究基于端粒酶自放大作用和链替代循环反应双重信号放大,建立了一种检测细胞内端粒酶活性的比率型荧光共振能量转移法。羧基荧光素和四甲基罗丹明标记的两种发夹 DNA 分子(FAM-H1、TAMRA-H2)、辅助 DNA(A-DNA/T-DNA)、以及端粒酶引物DNA(TS)被二氧化锰纳米片运送到细胞内。细胞内的谷胱甘肽将二氧化锰纳米片分解成锰离子,从而释放出DNA分子。当细胞内含有端粒酶时,端粒酶可以将TS引物DNA延长,形成具有多个重复TTAGGG单元的端粒DNA延长产物。端粒DNA延长产物与多个A-DNA/T-DNA中的A-DNA互补,从而释放出多个T-DNA,实现第一步信号放大。T-DNA可引发FAM-H1和TAMRA-H2之间发生循环链替代反应,形成大量FAM-H1/TAMRA-H2杂交双链,完成第二步信号放大。在双链末端FAM和TAMRA距离相互靠近,从而发生荧光共振能量转移。根据荧光比率变化,实现可靠、灵敏检测端粒酶活性。该方法可检测出20个HeLa细胞当量的端粒酶活性。荧光成像分析表明,该方法可区分肿瘤细胞和正常细胞内端粒酶活性的差异。因此,该方法是一种简便、灵敏、可靠检测细胞内端粒酶活性的荧光法。