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目的:研究长链非编码RNA FEZF1-AS1在结肠癌组织和细胞中的表达及对结肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭等能力的影响。方法:1.应用RT-qPCR(实时荧光定量PCR)法检测结肠癌组织及其对应癌旁正常组织中FEZF1-AS1的表达水平,并对FEZF1-AS1的表达水平和结肠癌患者临床和病理参数之间的相关性进行分析。2.应用RT-qPCR法检测5株结肠癌细胞系(SW480,HCT116,DLD-1,RKO和HT29)和正常肠上皮细胞NCM460中FEZF1-AS1的表达水平。3.应用MTS法、克隆形成法、划痕愈合实验、Transwell迁移和Matrigel侵袭实验检测敲低FEZF1-AS1基因对结肠癌细胞SW480和HCT116增殖活性、克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力的影响。结果:1.RT-qPCR实验数据显示,与癌旁正常组织相比,结肠癌组织中FEZF1-AS1表达明显上调,其表达水平与T分期(肿瘤浸润深度)以及TNM分期呈正相关。2.RT-qPCR实验数据显示,与正常肠上皮细胞NCM460相比,SW480,HCT116,DLD-1和HT29结肠癌细胞株中FEZF1-AS1表达明显升高,而结肠癌细胞株RKO中FEZF1-AS1表达未见明显差异。3.MTS实验数据显示,敲低FEZF1-AS1基因可导致结肠癌细胞SW480和HCT116增殖能力明显降低。4.克隆形成实验检测结果显示,敲低FEZF1-AS1基因可导致结肠癌细胞SW480和HCT116的克隆形成能力明显受到抑制。5.划痕愈合实验检测结果显示,敲低FEZF1-AS1基因可导致结肠癌细胞SW480和HCT116的划痕愈合能力明显降低。6.Transwell和Matrigel侵袭实验检测结果显示,敲低FEZF1-AS1基因可导致结肠癌细胞SW480和HCT116的迁移和侵袭能力明显降低。目的:研究FEZF1-AS1通过OTX1调节EMT发生发展的作用机制。方法:1.应用结肠癌细胞SW480和HCT116,RT-qPCR法和Western blot法检测敲低FEZF1-AS1基因对结肠癌细胞中OTX1表达的影响,应用Western-blot法检测敲低FEZF1-AS1基因后,结肠癌细胞EMT相关蛋白表达变化。2.同时敲低FEZF1-AS1和过表达OTX1后,应用Western blot法检测对EMT相关蛋白表达水平的影响。3.应用免疫组织化学法检测结肠癌组织和癌旁组织中OTX1蛋白的表达水平,并分析FEZF1-AS1与OTX1表达的相关性。结果:1.RT-qPCR实验数据显示,与si-NC转染组相比,敲低FEZF1-AS1基因后,结肠癌细胞中OTX1表达无明显差异,Western-blot法检测结果显示,敲低FEZF1-AS1基因后,结肠癌细胞中OTX1表达降低;敲低FEZF1-AS1基因后,结肠癌细胞EMT相关蛋白E-Cadherin表达升高,N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平减低。2.Western blot实验显示,同时敲低FEZF1-AS1和过表达OTX1,可部分抑制E-Cadherin和部分恢复N-Cadherin和Vimentin蛋白的表达。3.免疫组织化学实验显示,与相应结肠癌癌旁正常组织相比,结肠癌组织中OTX1表达升高,FEZF1-AS1与OTX1表达水平呈正相关。目的:研究FEZF1-AS1作为ce RNA,与m RNA NT5E竞争性结合miR-30a-5p,进而影响结肠癌的发生发展。方法:1.应用生物信息学工具Starbase预测与FEZF1-AS1结合的miRNA,应用RT-qPCR法检测敲低FEZF1-AS1后四种miRNA的表达变化,筛选出miR-30a-5p,进一步明确敲低和过表达miR-30a-5p对FEZF1-AS1的表达的影响。并应用双荧光素酶报告试验验证FEZF1-AS1和miR-30a-5p的结合位点。2.应用MTS和Transwell迁移实验检测过表达miR-30a-5p基因对结肠癌细胞SW480和HCT116增殖活性和迁移能力的影响。3.应用RT-qPCR法检测结肠癌组织及对应癌旁正常组织中miR-30a-5p的表达水平,并分析其与FEZF1-AS1表达水平相关性。4.利用Target Scan,Target Miner和miRDB三个数据库预测出与miR-30a-5p结合的m RNA NT5E,并应用双荧光素酶报告试验验证miR-30a-5p和NT5E的结合位点。5.敲低或过表达miR-30a-5p,Western blot法检测对结肠癌细胞中NT5E蛋白表达的影响。6.同时敲低FEZF1-AS1和miR-30a-5p,应用MTS和Transwell迁移实验,明确对结肠癌细胞SW480和HCT116增殖活性和迁移能力的影响。7.同时敲低FEZF1-AS1和miR-30a-5p,应用Western blot方法检测对结肠癌细胞SW480和HCT116中NT5E蛋白表达的影响。8.应用免疫组织化学实验分析结肠癌组织和其癌旁组织中NT5E的表达水平,并分析NT5E与FEZF1-AS1和miR-30a-5p表达的相关性。结果:1.应用生物信息学工具Starbase预测了与FEZF1-AS1结合的4种miRNA:miR-610,miR-4443,miR-107和miR-30a-5p。RT-qPCR结果显示,敲低FEZF1-AS1可导致miR-30a-5p明显升高;敲低或过表达miR-30a-5p可导致FEZF1-AS1表达升高或降低;双荧光素酶报告试验结果显示FEZF1-AS1的片段B是miR-30a-5p的结合位点。2.过表达miR-30a-5p可抑制结肠癌细胞SW480和HCT116增殖活性和迁移能力。3.与相应结肠癌癌旁组织相比,结肠癌组织中miR-30a-5p表达降低,其表达水平与FEZF1-AS1表达呈负相关。4.利用Target Scan,Target Miner和miRDB三个数据库预测出miR-30a-5p靶蛋白NT5E,双荧光素酶报告试验结果显示,miR-30a-5p可结合在NT5E的3’UTR区。5.敲低miR-30a-5p可增加结肠癌细胞中NT5E蛋白的表达,而miR-30a-5p过表达则可明显抑制结肠癌细胞中NT5E蛋白的表达。6.同时敲低FEZF1-AS1和miR-30a-5p,可部分恢复结肠癌细胞SW480和HCT116增殖活性和迁移能力。7.同时敲低FEZF1-AS1和miR-30a-5p,可部分恢复结肠癌细胞SW480和HCT116中NT5E蛋白的表达。8.与相应结肠癌癌旁组织相比,结肠癌组织中NT5E表达明显升高,且NT5E与FEZF1-AS1表达呈正相关,NT5E与miR-30a-5p表达呈负相关。目的:研究抑制FEZF1-AS1对裸鼠体内结肠癌移植瘤生长的影响。方法:1.应用慢病毒侵染结肠癌细胞株,构建能稳定抑制FEZF1-AS1的结肠癌细胞株HCT116,构建结肠癌移植瘤模型。2.将稳定抑制FEZF1-AS1组和对照组细胞注入裸鼠体内,观察移植瘤的生长,按时间测量并记录移植肿瘤体积和重量。3.应用RT-qPCR和免疫组织化学实验,检测两组裸鼠移植瘤组织中FEZF1-AS1、OTX1以及NT5E的表达情况。结果:1.成功构建稳定敲低FEZF1-AS1的结肠癌细胞株HCT116。2.与sh-NC-HCT116组相比,sh-FEZF1-AS1-HCT116组裸鼠体内移植瘤重量减轻,体积减小。3.与对照组相比,稳定抑制FEZF1-AS1的移植瘤组织中FEZF1-AS1、OTX1以及NT5E在m RNA以及蛋白水平均表达降低。结论:FEZF1-AS1在结肠癌组织中表达升高,与肿瘤浸润深度和TNM分期相关。敲低FEZF1-AS1表达可减低结肠癌细胞的增殖活性、克隆形成、迁移和侵袭能力,这些功能的改变与FEZF1-AS1与OTX1蛋白相互作用,进而影响EMT相关蛋白的表达有关。FEZF1-AS1可能作为ce RNA,与m RNA NT5E竞争性结合miR-30a-5p,可能同时参与促进结肠癌进展的过程。体外成瘤实验说明,敲低FEZF1-AS1表达可抑制结肠癌细胞在裸鼠体内的增殖活性。