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背景和目的:很多原因可导致局部的皮肤组织缺损和机体畸形,如先天性畸形、外伤、肿瘤术后等等,特别是乳腺和颜面部肿瘤的术后常常造成整个器官的残缺。目前临床上治疗方法庞杂,主要以自体组织和人工材料进行填充或修复,虽然该治疗方法有一定效果,但它们仍存在着许多的缺点。近来脂肪移植因其来源于自身、取材广并且方便,并且无组织排斥反应受到外界广泛关注,早期有脂肪块移植,后期转为颗粒脂肪移植,有助于提高成活率,但仍不是很理想,颗粒脂肪移植容易被吸收,成活率不高,脂肪液化坏死、钙化等缺点仍存在。脂肪干细胞（ASCs）是来自于自身体内的皮下脂肪组织,再生能力强。血小板浓缩物的应用已久,它通过促进愈合过程中各个阶段的血管生成从而对组织再生产生影响。PRF及A-PRF是从抽取人体静脉血中经加工离心后得到的凝胶状物质,富含血小板和纤维蛋白,被证实在软组织重建治疗具有一定的潜在应用价值,但对ASCs增殖、成脂分化功能的影响尚不明确。本研究拟探讨A-PRF分泌生长因子的状况及在体内、外环境对ASCs增殖、成脂分化功能的影响,同时探索ASCs成脂分化功能在软组织重建中的实际作用及意义。材料和方法:预实验:从健康成人皮下脂肪组织提取ASCs,进行分离培养、判定与扩增,传至第3代细胞,观察及记录细胞形态及相关生物学特性检测,优化及规范提取、培养及诱导操作流程。组织培训:明确课题组各成员的任务并对课题组成员进行培训,明确和统一课题研究的方法、方式和目的。具体内容为:统一实验观察指标,细胞及动物的分组方法,检测指标结果的收集,数据分析以及工作计划、要求、完成时间等。1.人脂肪干细胞（Human Adipogenic differentiation augmenting of adipose-derived stromal cells,hASCs）的分离培养、鉴定。从6名接受了吸脂手术女性患者中获取脂肪组织,并消化分离出P0hASCs。经过三次传代后,评估P3 hASCs的成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞的分化能力。应用免疫荧光染色鉴定hASCs特异性细胞表面标志物,CD29、CD44、CD45、CD54、CD105、CD49和CD106的表达状况。2.体外实验检测A-PRF对hASCs增殖、成脂分化功能的影响:（1）将P3 hASCs分别以下列六组培养基条件培养（说明:除BM组完全培养基中添加10%胎牛血清外,其它各组完全培养基中添加2%胎牛血清）,20%A-PRFe组:20%A-PRFe的BM培养,10%A-PRFe组:10%A-PRFe的BM培养,5%A-PRFe组:5%A-PRFe的BM培养,2.5%A-PRFe组:2.5%A-PRFe的BM培养,阴性对照0%A-PRFe组:0%A-PRFe的BM培养,阳性对照组BM组:基本培养基（basal medium,BM）,各组细胞均含3个培养基,在相应条件下培养7天,通过CCK-8试验检测各组培养基的吸光值（OD值）,并取各组每天的吸光值平均数,行统计学分析。（2）将hASCs分别以下列五组培养基条件培养,Control组及0%A-PRFe组:仅成脂诱导培养基（Adipogenic induction medium,AIM）,2.5%A-PRFe组:2.5%A-PRFe的AIM培养,5%A-PRFe组:5%A-PRFe的AIM培养,10%A-PRFe组:10%A-PRFe的AIM培养,20%A-PRFe组:20%A-PRFe的AIM培养,各组细胞在相应条件下培养14天后通过油红O染色实验、细胞密度、脂质浓度检测证明A-PRFe对hASCs成脂肪分化能力的影响。3.体外实验探索A-PRF分泌生长因子的功能。将从健康成人身上抽取静脉血15ml,分3支一次性无菌采血管装,每管5ml,置于无菌负压采血管内,1500rpm/min离心14min,可见自体全血共分为三层结构:最上层:贫血小板血浆（PPP）;中间层:PRF膜;最下层:红细胞碎片（RBC）。去除最上层和最下层即为初级的A-PRF凝胶,并做好标记,分别于第1/3/7/14/21天在每天的同一时间检测VEGF、b-FGF、EGF、PDGF-AB、PDGF-BB、IGF-1、TGF-β、IL-1β和IL-4分泌水平,并做好记录。4.动物体内移植实验探索A-PRF对hASCs成脂分化功能的影响。设立处理组和对照组,分别为A组:纳米脂肪+A-PRF+颗粒脂肪,B组:纳米脂肪+颗粒脂肪,C组:A-PRF+颗粒脂肪,D组对照组:单纯颗粒脂肪。将四组材料分别植入8只裸鼠背部右后、左后、右前、左前部位,并做好标记,正常喂食,期间拍照。4个月后处死动物并解剖移植部位的组织,观察大体情况并称重,测量保有率,（公式:保有率=残余物的重量/移植初的重量）,通过大体观察,称重移植前后的质量、取组织做冰冻切片、油红O染色、HE染色、测量脂肪密度和脂质含量。结果:1.在初始分离和扩增（P1）后可观察到同质的hASCs,培养7-14天达到80-90%的融合。细胞以纺锤形形态单层生长,并表现出较强的增殖能力。通过油红O、茜素红、阿尔新蓝阳性染色证实hASCs可诱导分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。免疫荧光染色结果显示CD29、CD44、CD45、CD54和CD105表达的量较高,而CD49和CD106表达相对低。2.A-PRF自身分泌功能检测中,可分泌多种生长因子,其中VEGF、b-FGF、PDGF-AB、PDG-BB、IGF-1、IL-4因子第1天到第7天呈增长趋势,第7天达峰值,随后下降趋势;EGF、TGF-β、IL-1β第1天到第14天分泌呈增长趋势,且第14天时达到峰值,随后下降趋势。3.A-PRF对ASCs生长增殖功能的影响:使用CCK-8检测对第3代hASCs细胞进行增殖评估。所有组中的细胞增殖群体均呈现不同的增长趋势.到达第5天后均趋于平稳。将每天测得的数据进行统计分析,第1天检测20%A-PRFe与10%A-PRFe、5%A-PRFe、BM组差异有显著意义（P0.05）,10%A-PRFe组与5%A-PRFe、2.5%A-PRFe、0%A-PRFe和BMA组差异有意义（P0.05）,其它各组之间差异显著（P<0.05）。第3天各组之间差异均显著（P0.05）,其余各组间均有显著性差异（P0.05）,其余各组间均有显著性差异（P<0.05）。A-PRFe能够显著促进hASCs增殖并呈浓度依赖性,在一定范围内（2.5%-20%）的A-PRFe的刺激浓度越高hASCs增殖能力越强,使用ANOVA评估。经A-PRFe刺激的hASCs成脂诱导后与单纯AIM培养的细胞相比胞浆内可观察到较大油红O染色阳性脂滴,不同浓度A-PRFe组的脂肪细胞数量和脂质浓度均高于对照组（P<0.05）,且呈现正向剂量依赖效应,A-PRFe浓度越高,脂肪细胞数量和脂质浓度随之增加。4.（1）8只裸鼠背部左前、左后、右前、右后侧四个部位,所有动物均在接受移植术后4个月可见移植部位仍均有移植物残留。肉眼观各组残留组织的肉眼观察结果。A组体积最大,C组其次,D组最小。（2）A组保有率较其他三组显著更高,经统计学分析,A组与其他三组差异有显著意义（P0.05）,B组和C组较D组比较,有显著差异（P<0.05）。（3）残留组织的H＆E染色并分别在不同放大倍数下观察（A1-D1 100倍,A2-D2 200倍,A3-D3 400倍）。A组成熟脂肪细胞多,成纤维化少于其他组,且脂肪细胞更多并且更大,BC两组相当,D组最少,细胞稀疏,体积也小;（4）油红O染色（A4-D4）,四组均显阳性,A组中包含的油红O阳性脂质滴更多,D组最少。（5）成熟脂肪细胞密度:A组较其他三组明显多,C组其次,D组最少,且各组间差异显著（P<0.05）;（6）脂质含量:A组的脂肪细胞内脂质含量较其他三组明显增多（P0.05）,D组和B、C、D三组比较,差异显著（P<0.05）。结论:1.ASCs具有很强的增殖能力。ASCs具有向脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞分化的潜能。2.A-PRF可以分泌多种因子,其中VEGF、b-FGF、PDGF-AB、PDG-BB、IGF-1、IL-4因子第7天达峰值;EGF、TGF-β、IL-1β第14天时达到峰值。3.A-PRF可以优化hASCs增殖和成脂分化功能并呈浓度依赖性,在一定浓度范围内（2.5%-20%）的A-PRF的刺激浓度越高hASCs增殖功能越强。4.A-PRF可以优化hASCs在体内的成脂分化功能,提高新生组织中成熟脂肪细胞数量及脂质含量的浓度,获得体积和重量更大的新生组织。