柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）作为致病性最强的一种鸡球虫,每年对全球养殖业造成了严重的危害。目前,使用抗球虫药物是控制鸡球虫病最常见的措施,但由于这些药物的不断使用,耐药性虫株被不断发现。另一方面球虫活疫苗具有导致鸡群球虫病暴发的风险,因此新型抗球虫疫苗的研究成为人们关注的焦点。VPS29蛋白作为真核细胞中一类参与内涵体与高尔基体和质膜间货物逆运输,以及维持其他生理活动的关键性蛋白,先后在酵母细胞、动物细胞和植物细胞中发现,在顶复合器门原虫中的研究还很少。对柔嫩艾美耳球虫VPS29蛋白亚细胞定位和免疫学功能的研究,可以了解柔嫩艾美耳球虫中VPS29蛋白的分布情况,同时明确了VPS29蛋白是否具有成为候选抗原蛋白的潜力。本研究以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,按照Gen Bank中柔嫩艾美耳球虫VPS29预测序列设计引物,通过RT-PCR的方法扩增到柔嫩艾美耳球虫VPS29基因序列,再使用生物分析软件对VPS29基因序列进行初步预测分析。使用VPS29序列分别构建原核表达载体VPS29-p ET32a（+）和VPS29过表达定位载体Et H4-VPS29-EYFP-Actin。将VPS29-p ET32a（+）转化至BL21大肠杆菌中经过IPTG诱导表达,再经过Ni-NTA亲和柱纯化,得到VPS29重组蛋白。为了评价VPS29蛋白的免疫保护效果,本研究设三组进行鸡攻毒试验,分别为免疫组（免疫攻虫组）、阳性组（不免疫攻虫组）和阴性组（不免疫不攻虫组）。使用100μg VPS29重组蛋白与弗氏佐剂1:1充分混合后经颈部皮下注射免疫7日龄雏鸡,之后每隔两周用同剂量VPS29重组蛋白进行两次加强免疫。免疫三次后进行攻毒试验,攻毒期间监测其增重、死亡情况、卵囊排出情况等数据,攻毒后进行剖检,观察盲肠病变情况。最后综合数据分析,评价VPS29重组蛋白的免疫保护效果。为了对VPS29进行亚细胞定位,本研究使用VPS29重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光的方法进行柔嫩艾美耳球虫子孢子定位。同时将构建好的Et H4-VPS29-EYFP-Actin表达载体经过电转染的方法转入子孢子,将该子孢子接种鸡后获得VPS29-EYFP转基因柔嫩艾美耳球虫转基因虫株,通过表达的黄色荧光对VPS29进行定位。本研究PCR扩增的VPS29序列与预测序列的同源性为100%,该序列编码了183个氨基酸,在二级结构中存在α螺旋、β折叠及转角等多种结构,并且预测到具有9个抗原决定簇,与和缓艾美耳球虫和弓形虫VPS29序列的同源性最近,分别为81.6%和71.24%。VPS29重组蛋白对鸡的免疫保护结果显示,攻虫后三组鸡均没有死亡病例。免疫组鸡的增重低于阴性组但差异不显著（P＞0.05）,而阳性组的增重明显低于阴性组（P＜0.05）;免疫组的卵囊排出量小于阳性组但差异不显著（P＞0.05）;盲肠病变方面来看免疫组比阳性组病变较轻但差异不显著（P＞0.05）;最终综合以上数据分析免疫组ACI为144.2。对鸡血清的Western-blot和ELISA结果表明VPS29重组蛋白免疫可使鸡产生特异性抗体。对VPS29蛋白的亚细胞定位结果表明,VPS29蛋白在柔嫩艾美耳球虫子孢子的胞质内广泛存在。试验结果表明,VPS29序列在顶复合器门原虫中具有保守性;VPS29重组蛋白对鸡的免疫后可产生部分保护力,但保护效果较差。揭示了VPS29蛋白无法作为优秀的疫苗候选抗原;VPS29是柔嫩艾美耳球虫中广泛存在的一种蛋白,预示着VPS29蛋白可能是柔嫩艾美耳球虫中重要的功能性蛋白,其生物学功能需要进一步的研究挖掘。