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副猪嗜血杆菌（Gaemophilus parasuis,GPS）是影响养猪业重要的细菌性病原之一,主要引起关节炎、脑膜炎和纤维素性浆膜炎等症状。在前期的研究中发现GPS的主要外膜蛋白Omp P2可诱导肺泡巨噬细胞IL-17 mRNA表达增加。IL-17细胞因子是一种重要的炎症介质,但IL-17介导GPS炎症反应中的作用和相关机制尚不清楚。本研究以GPS强毒Nagasaki菌株为主要研究对象,研究IL-17在体内外表达情况和在炎症反应过程中的作用,分析NF-κB和MAPK相关通路中关键蛋白,探索GPS在体外诱导IL-17产生的分子机制,为IL-17在GPS诱导机体炎症反应中的作用及机制提供理论支持。相关研究结果如下:1.GPS Nagasaki菌株感染仔猪的IL-17表达水平变化为了研究GPS如何诱导仔猪IL-17促炎细胞因子的表达,通过用GPS强毒Nagasaki菌株腹腔注射仔猪（8×10~9CFU/头）。通过采集24 hpi和48 hpi的仔猪外周血液进行流式细胞分析,发现48 hpi的外周淋巴血中CD3+CD4+T、CD3+CD8+T和CD3+CD4+IL-17+T细胞的比例显著增加（p＜0.05或p＜0.01）,分别增加了1.18倍、1.21倍和20.63倍。通过Real-time PCR和ELISA检测仔猪不同组织IL-17 mRNA和蛋白含量。GPS感染过程中肺脏的IL-17蛋白（24 hpi,1.48倍;48 hpi,2.16倍）和mRNA（24 hpi,33倍;48 hpi,43倍）表达水平显著高于正常组织。同样,在脾脏中,IL-17蛋白（24hpi,1.33倍;48 hpi,2.16倍）和mRNA（24 hpi,8倍;48 hpi,10倍）表达水平显著高于正常组织,以上结果说明了GPS的感染可以诱导脾脏和肺脏中IL-17 mRNA和蛋白水平显著增加,且具有时间依赖性。为了研究GPS感染仔猪肺脏和脾脏的病理损伤及IL-17的表达情况,通过在24hpi和48 hpi进行病理学检查和免疫组化分析。HE染色观察,在24 hpi出现炎性细胞浸润,并且肺脏和脾脏病理损伤严重程度也随感染时间的延长而加重。免疫组化观察IL-17阳性蛋白表达随感染时间显著增加。通过收集肺脏和脾脏组织进行活菌计数,发现细菌载量随感染时间延长而增多。因此,我们可以推断IL-17蛋白表达与细菌在肺和脾中的含量、组织病理损伤程度均呈正相关,说明IL-17参与了GPS感染仔猪过程中的炎症反应。2.GPS通过PKC-ERK/MAPK和IκB/NF-κB信号通路诱导IL-17的产生为了探究GPS在体外是否诱导IL-17的表达,利用Nagasaki菌株感染PUVEC、PK-15、3D4/2、IPEC-J2细胞系和原代PAMs共5种不同细胞。结果显示GPS原代PAMs表达量上调最为显著,且IL-17表达量呈时间和剂量依赖。为了验证GPS强毒株和弱毒株诱导的宿主细胞表达IL-17能力的差异,用GPS强毒力Nagasaki菌株和弱毒力C5（血清8型）菌株分别感染原代PAMs。结果显示,与Nagasaki菌株相比,C5株诱导PAMs IL-17 mRNA表达能力显著下降约66.2%。因此,GPS可以显著诱导PAMs IL-17 mRNA的表达,且呈时间剂量依赖性,但强弱毒株之间诱导IL-17表达水平有显著差异。以上结果表明,GPS感染宿主细胞可诱导IL-17的显著表达。为了探究GPS感染PAMs诱导IL-17反应过程中激活了哪些信号通路相关蛋白,用信号通路相关蛋白抑制剂,MEK1/2抑制剂AZD8330,JNK抑制剂SP600125,P13K抑制剂LY294002,m TOR抑制剂KU-0063794,PKC抑制剂GF109203X,NF-κB抑制剂BAY11-7082分别作用于细胞,检测IL-17 mRNA水平。发现PKC（GF109203X）,MEK（AZD8330）和NF-κB（BAY11-7082）抑制剂具有抑制IL-17表达的能力,且呈剂量依赖性。为了进一步证实GPS感染PAMs细胞诱导PKC、MEK和NF-κB信号路蛋白PKC、ERK1/2和IκB情况,用western blot检测PKC、ERK1/2和IκB总蛋白及磷酸化水平。发现Nagasaki菌株感染的PAMs中PKC、ERK 1/2和IκB的磷酸化水平随感染量的增加而显著增加,与阴性对照组相比有显著差异（p＜0.05或p＜0.01）。结果说明,GPS通过PKC-ERK/MAPK和IκB/NF-κB信号通路诱导IL-17的产生。3.GPS感染PK-15细胞过程中IL-17介导下游炎症因子IL-6的表达为了研究IL-17的表达对下游细胞因子的影响情况,首先通过构建慢病毒重组质粒,将其转染至HEK293T细胞,包装获得慢病毒颗粒,然后感染PK-15细胞,利用嘌呤霉素进行筛选。结果显示,成功获得IL-17过表达及沉默稳转的细胞株,并通过RT-q RCR和western blot鉴定正确。为了探究GPS感染过程中IL-17在PK-15细胞中介导下游炎症因子表达情况,通过用Nagasaki菌株分别感染PK-15 PCDH-IL-17和PK-15。结果发现GPS诱导细胞中炎症细胞因子IL-6 mRNA和IL-8 mRNA的表达显著上升,并且IL-17过表达会影响IL-6和IL-8 mRNA的表达的增加。为了进一步说明GPS感染PK-15,IL-17是如何影响IL-6的产生,利用m TOR抑制剂KU-0063794,PKC抑制剂GF109203X,MEK1/2抑制剂AZD8330和NF-κB抑制剂BAY11-7082分别作用于细胞,检测IL-17mRNA表达水平。结果发现MEK（AZD8330）抑制剂可以抑制IL-17 mRNA的表达,IL-17 mRNA的表达显著下降。同时,发现IL-6 mRNA表达量下降。为了进一步证实IL-6产生机制,用western blot检测ERK1/2总蛋白及磷酸化水平。发现Nagasaki菌株感染PK-15过程中,可激活ERK1/2蛋白上调IL-6表达。为了进一步证实这一推断,通过GPS Nagasaki菌株感染PK-15 sh IL-17-3细胞,发现IL-6 mRNA表达水平降低。综上所述,可以推断在GPS感染PK-15细胞过程中IL-17介导下游炎症因子IL-6的表达。本研究探索了IL-17参与GPS炎症反应的过程,GPS诱导原代PAMs IL-17产生通过PKC-ERK/MAPK和IκB/NF-κB信号通路及IL-17介导下游炎症因子IL-6的表达。这为研究其致病机制及抗菌药物提供理论参考。