背景与目的:软骨缺损的临床治疗是骨科界的治疗难点。骨髓间充质干细胞（BMSCs）被认为是软骨缺损修复治疗的理想种子细胞。如何高效地促进BMSCs的定向分化为软骨是软骨组织修复的关键。课题组前期研究发现,补肾名方二至丸中的有效成分蟛蜞菊内酯可促进BMSCs的成软骨分化,并可显著上调软骨分化核心转录因子Sox9的表达。但蟛蜞菊内酯调控Sox9的机制尚不明确,值得深入探讨。深入研究发现,蟛蜞菊内酯可靶向结合RNA甲基化酶Nsun4并促进其表达。基于此,本研究提出科学假说:蟛蜞菊内酯可能通过调控RNA甲基化酶Nsun4从而引起RNA甲基化修饰改变表观调控BMSCs成软骨分化。本研究通过建立BMSCs定向分化软骨小球模型及软骨缺损动物模型,探索RNA甲基化酶Mettl3及Nsun4对软骨分化的作用及蟛蜞菊内酯的调控的分子机制。方法:1.通过BMSCs定向分化构建软骨小球模型,研究蟛蜞菊内酯对BMSCs成软骨分化的促进作用。（1）采用经典诱导培养基诱导7天构建BMSCs定向成软骨分化的软骨小球模型,并采用RT-qPCR及Western blot检测成软骨分化标志基因的表达水平;（2）通过CCK8确定蟛蜞菊内酯对BMSCs产生细胞毒性的浓度并通过RT-qPCR筛选蟛蜞菊内酯的最佳作用浓度;（3）蟛蜞菊内酯在最适浓度诱导成软骨分化后,RT-qPCR检测成软骨分化标志基因的蛋白表达水平;（4）蟛蜞菊内酯干预软骨小球模型,通过Dot-blot法检测RNA甲基化m5C及m6A的水平改变;（5）使用软骨小球模型,通过RNA-seq、RT-qPCR、RNA干扰技术及Dot-blot法删选软骨分化中RNA甲基化所依赖的甲基转移酶;（6）在软骨小球模型中加入蟛蜞菊内酯干预,通过Western blot、RT-qPCR法检测各组细胞中Mettl3与Nsun4的蛋白及m RNA表达量。（7）运用薛定谔软件预测蟛蜞菊内酯与蛋白Nsun4及Mettl3是否可结合;（8）采用蛋白纯化及SPR技术,在体外检测蟛蜞菊内酯靶向结合与RNA甲基化酶Nsun4。2.通过软骨小球模型,联合转录组、翻译组及蛋白组分析BMSCs成软骨分化的相关基因翻译水平的变化。运用生物信息学对主成分及差异基因进行分析,比较各组学检测的差异性;通过个组学相关性分析,确定翻译组学的桥梁作用;联合转录组及翻译组学,分析成软骨分化基因的翻译效率改变。3.通过软骨小球模型及大鼠软骨缺损模型,研究BMSCs定向成软骨分化时,RNA甲基化酶Nsun4/Mettl3对软骨分化核心转录因子Sox9的调控机制。（1）构建BMSCs定向诱导的软骨小球模型,采用Dot-blot检测诱导成软骨后总m RNA中m5C及m6A水平,并通过RIP-qPCR检测Sox9 m RNA的m5C及m6A水平;（2）通过Western blot及RT-qPCR检测BMSCs成软骨分化后,Nsun4与Mettl3的蛋白和m RNA表达量的改变;（3）通过RNA干扰片段敲降Nsun4及Mettl3,观察成软表型,并采用Western blot检测标志基因的改变,Dot-blot检测m5C及m6A水平的改变;（4）通过RIP-qPCR检测BMSCs成软骨分化后Nsun4与Mettl3结合Sox9 m RNA量的改变;（5）通过CO-IP检测Nsun4与Mettl3的互作,并采用RIP-qPCR检测Nsun4/Mettl3结合Sox9 3’UTR的水平以及Sox9 3’UTR区m5C及m6A水平的变化;（6）SRAMP网站（http://www.cuilab.cn/sramp）预测Sox9 3’UTR上的m6A位点,并以此范围为目标采用重亚硫酸盐测序确定m5C位点,RIP-qPCR确定m6A位点;敲降Nsu4及Mettl3诱导成软骨分化后,检测m6A位点及m5C位点的水平改变;（7）采用CO-IP LC/MS检测Nsun4结合的蛋白,进一步采用Western blot验证;并探索m5C及m6A可能的阅读蛋白及其对Sox9的调控作用;（8）构建Sox9 3’UTR驱动的荧光素酶报告基因系统,确定Mettl3/Nsun4/Ythdf2/e EF1a-1对Sox9 3’UTR的调控是否影响其翻译过程,并通过RT-qPCR确定Mettl3/Nsun4/Ythdf2对Sox9转录过程的调控;（9）采用原核表达系统纯化Mettl3/Nsun4/Ythdf2/e EF1a-1蛋白,运用SPR技术在体外探索四个蛋白的结合模式;（10）构建大鼠软骨缺损模型,采用腺相关病毒侵染BMSCs过表达Mettl3与Nsun4,通过免疫荧光检测成软骨分化相关基因的表达水平。结果:1.中药小分子促进BMSCs成软骨分化部分（1）BMSCs诱导培养7天后,可观察到软骨小球的形成,表面光滑,直径约为2mm;RT-qPCR及Western blot分别检测成软骨分化标志基因Sox9,Aggrecan及Col2的表达,结果表明与正常组相比,软骨小球中Sox9,Aggrecan及Col2的RNA及蛋白表达水平显著升高。（2）CCK8实验结果显示,蟛蜞菊内酯的工作浓度在80nm范围内对细胞无毒副作用;进一度设置浓度梯度诱导BMSCs成软骨分化,RT-qPCR结果表明蟛蜞菊内酯工作浓度为10nm时可显著上调成软骨标志基因Sox9及Col2的表达,确定10nm为蟛蜞菊内酯的最适工作浓度。（3）BMSCs成软骨分化中,蟛蜞菊内酯诱导组可正常成球,且表面光滑,直径约2mm;Western blot结果显示,相较于诱导组,蟛蜞菊内酯诱导组可显著上调成软骨标志基因Sox9、Col2的蛋白表达。（4）蟛蜞菊内酯诱导BMSCs成软骨分化后,Dot-blot结果显示,与诱导组相对比,蟛蜞菊内酯诱导组的m5C及m6A水平上调;采用RNA-seq及RT-qPCR删选m5C甲基转移酶的表达,结果显示Nsun4的表达显著下降,Nsun6的表达显著上升;分别敲降Nsun4与Nsun6诱导成软骨分化,Dot-blot结果显示,与诱导组相比,敲降Nsun6诱导组的m5C水平无差异变化,敲降Nsun4诱导组的m5C水平显著下降;m6A主要由甲基转移酶Mettl3催化,敲降Mettl3诱导后,相对于诱导组,m6A的水平显著下调。（5）蟛蜞菊内酯干预成软骨分化后,Western blot及RT-qPCR结果显示,相对于诱导组,蟛蜞菊内酯组可显著上调Nsun4与Mettl3蛋白及RNA的表达。进一步,分子对接结果显示蟛蜞菊内酯可结合Nsun4,结合分数为-6.235,证明结合力较高,而与Mettl3的结合不明显。纯化Nsun4蛋白,采用SPR技术体外验证Nsun4与蟛蜞菊内酯的结合,结果显示蟛蜞菊内酯可与Nsun4结合,且为缓慢结合缓慢解离的结合方式。2.BMSCs成软骨分化及生物信息学研究部分（1）通过转录组与翻译组数据的主成分分析发现正常组与诱导组在转录和翻译水平上有明显的分离趋势。（2）差异表达基因分析发现转录组差异表达基因有315个,翻译组差异表达基因有2384个。（3）相关性分析结果显示,正常组皮尔森相关系数R~2=0.4496,诱导组皮尔森相关系数R~2=0.5882,转录组与翻译组存在相关性。进而联合转录组与翻译组进行分析,结果发现,相对于正常组,诱导组中整体RNA的核糖体分布显著升高,且3’UTR区相较其他区域升高显著;在翻译效率上,诱导后整体基因的翻译效率升高,翻译效率差异基因分析发现,诱导后上调的基因有2253个,下调的的基因有142个,其中与成软骨分化相关的基因翻译效率显著上升;诱导后,核心转录因子Sox9 RNA上的核糖体分布显著升高,差异具有统计学意义。3.RNA甲基化酶Mettl3/Nsun4表观共调控成软骨分化核心转录因子Sox9的机制研究部分（1）BMSCs成软骨分化后,Dot-blot结果显示,相对于正常组,诱导组的m5C及m6A水平显著上调;RIP-qPCR结果显示,诱导成软骨分化后,Sox9的m5C及m6A水平显著上升。（2）通过Western blot及RT-qPCR检测,与正常组相比,诱导组中Nsun4的蛋白及m RNA表达水平显著降低,而Mettl3的蛋白及m RNA表达水平显著上升;进一步分别敲降Nsun4与Mettl3诱导成软骨分化,结果显示敲降Nsun4与Mettl3软骨小球均出现空洞,不能成球,且Western blot结果证实,敲降Nsun4与Mettl3诱导组相对于诱导组,成软骨分化相关标志基因Sox9、Aggrecan及Col2的表达显著下降;Dot-blot实验证实,敲降Nsun4诱导组与诱导组相比,m5C水平显著下降,敲降Mettl3诱导组相对于诱导组,m6A水平显著下降。（3）RIP-qPCR结果显示,相对于正常组,诱导组中Nsun4与Mettl3结合Sox9RNA的水平显著上升。（4）CO-IP Western blot与Dot-blot结果显示,诱导成软骨分化后,Nsun4与Mettl3可形成复合物;且RIP-qPCR结果证实,诱导后Nsun4与Mettl3结合在Sox93’UTR的水平显著上升,且Sox9 3’UTR区的m5C及m6A水平显著升高。（5）Ribo-seq结果显示,诱导后,在Sox9 3’UTR区1950nt-2250nt的范围内,核糖体的分布显著升高;SRAMP网站预测Sox9 RNA上的m6A位点,结果表明在Sox93’UTR区（2020nt-2250nt范围）存在潜在的m6A位点。同时,重亚硫酸盐测序结果发现,Sox9 RNA上的第2062nt的位置是m5C位点。诱导后,m5C位点的甲基化水平显著升高,敲降Nsun4与Mettl3诱导后,m5C位点的甲基化水平显著降低;进而,RIP-qPCR实验证实Sox9 RNA上的2030nt为m6A位点,与m5C位点位置相近,敲降Nsun4与Mettl3后,该位点的m6A甲基化水平显著降低。说明Nsun4与Mettl3可结合在Sox9的3’UTR区,表观修饰m5C及m6A位点。（6）通过CO-IP LC/MS探索Nsun4的结合蛋白,结果表明在成软骨分化的过程中,Nsun4可结合Mettl3与翻译相关蛋白,其中包括翻译延伸因子e EF1a-1。CO-IP Western blot进一步证实,诱导后,Nsun4与Mettl3可结合e EF1a-1。（7）m5C与m6A可通过招募阅读蛋白影响RNA的翻译过程,Ythdf2家族是保守的m6A阅读蛋白。CO-IP Western blot结果证实,诱导后,Mettl3可显著结合Ythdf1-3,而Nsun4可结合Ythdf2,表明Ythdf2可特异性地与复合物Nsun4/Mettl3结合。敲降Ythdf2诱导成软骨分化,Western blot结果显示,相对于诱导组,敲降Ythdf2诱导组的Sox9蛋白表达水平显著下降,且RIP-qPCR结果表明,在诱导后,Ythdf2结合Sox9 m RNA的水平显著升高。（8）双荧光素酶报告基因结果显示,分别敲降Mettl3、Nsun4、Ythdf2及e EF1a-1后,Sox9的翻译水平显著下降;同时,分别敲降Mettl3、Nsun4及Ythdf2诱导后,相对于诱导组,Sox9的m RNA水平变化没有显著差异。（9）采用原核表达系统表达Mettl3、Nsun4、Ythdf2及e EF1a-1并纯化相应蛋白进行Biacore实验探索四个蛋白的结合模式,结果表明,Mettl4、Nsun4与Ythdf2两两相互结合形成复合物,其次,e EF1a-1结合于Ythdf2。（10）空载及过表达Nsun4与Mettl3的AAV病毒侵染BMSCs转移入大鼠软骨缺损模型的缺损处,饲养6周取材。免疫荧光检测成软骨标志基因表达,结果证明,与空载组相比,过表达Nsun4与Mettl3组的Sox9,Aggrecan及Col2的蛋白表达显著上升。结论:1.中药小分子蟛蜞菊内酯可靶向结合RNA甲基化酶Nsun4,调控Nsun4的表达,进而调节RNA的m5C甲基化水平,起到促进BMSCs成软骨分化的作用。2.转录组与翻译组学分析发现,BMSCs成软骨分化后,整体RNA的翻译增强,且RNA 3’UTR区核糖体分布增加;同时,整体水平上,基因翻译效率增加,与成软骨分化相关基因的翻译效率显著增强;软骨分化核心转录因子Sox9的翻译增强。3.在BMSCs成软骨分化的过程中,RNA甲基化酶Nsun4与Mettl3形成复合物靶向结合并甲基化修饰核心转录因子Sox9的3’UTR区;进一步招募阅读蛋白Ythdf2及翻译延伸因子e EF1a-1调控Sox9的翻译重编程,从而促进BMSCs成软骨分化;并于体外验证复合物NMYE（Nsun4/Mettl3/Ythdf2/e EF1a-1）的组装模式。