卵巢癌是妇科肿瘤死亡率最高的肿瘤，因其早期症状不明显，待到肿瘤发现时大部分已经是晚期，而且卵巢癌易于转移，即便是能早期发现行手术治疗，治疗后也需辅以化疗，因此大部分的卵巢癌患者都需要接受化疗。人工合成的糖皮质激素（GC）如地塞米松（Dex）因其能够减轻化疗所导致的恶心、呕吐以及组织水肿等毒副作用而作为化疗方案中的辅助用药常规应用于卵巢癌的治疗中。然而，近年来陆续有报道表明，GC能够抑制多种肿瘤细胞的凋亡作用，如GC在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌和卵巢癌等细胞系中，能明显抑制由化疗药物诱导的细胞凋亡，这些化疗药物包括顺铂、紫杉醇、5-Fu、阿霉素和放线菌素D。在其他一些上皮来源的肿瘤如神经胶质瘤以及神经纤维肉瘤等细胞中这种现象也被证实。Zhang C等在体内和体外实验中均证实GC处理胰腺癌细胞将诱导化疗耐药。但是关于糖皮质激素抵抗化疗的具体机制目前尚不很清楚。本实验旨在卵巢癌细胞系HO-8910和SKOV3中探讨Dex是否抵抗化疗药物顺铂和紫杉醇对卵巢癌的凋亡作用以及其可能的机制。本课题首先检测了顺铂、紫杉醇两种化疗药单独及联合Dex对卵巢癌HO-8910和SKOV3细胞存活的影响。结果表明，顺铂和紫杉醇单独作用能显著的以浓度依赖性的方式降低细胞的存活，但两者合用存活的细胞数却较单独顺铂组明显增加。本校病理生理学教研室之前的研究发现，用Dex处理HO-8910细胞和用无水乙醇处理细胞相比，胰酶消化细胞所需时间显著延长。分别用100nMDex和无水乙醇处理HO-8910细胞24小时后，用0.25%胰酶消化，所需的消化时间各自为163.5min、40.5min。在另一株卵巢癌细胞系SKOV3中也发现同样的现象。说明Dex可能增强了细胞与细胞外基质之间的粘附能力。为此我们进一步研究了Dex对细胞粘附能力的影响。细胞外基质（ECM）是由细胞合成并分泌到胞外，分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要分四大类，分别是胶原；非胶原糖蛋白，如纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、层粘连蛋白(laminin，LN)、玻璃粘连蛋白(vitronectin，VN)等；弹性蛋白；蛋白聚糖及氨基聚糖，如透明质酸（hyaluronic acid，HA）。由于Dex能够增加卵巢癌细胞与基质的粘附能力，而已知细胞与基质的粘附主要取决于细胞外的基质成分和细胞表面的粘附分子。因此我们首先观察了Dex对HO-8910细胞ECM成分表达与分泌的影响。细胞与ECM间的粘附是一个多因素参与的过程。其粘附能力的大小除了受ECM成分的影响外，还取决于细胞膜上的粘附分子的表达情况。介导细胞与ECM之间粘附的粘附分子主要是整合素家族和CD44家族。病理生理教研室前期的研究发现Dex能上调人卵巢癌HO-8910中整合素α4β1和α5β1的表达水平。为明确整合素β1亚基在Dex介导的促进细胞粘附和保护细胞对抗化疗药物促凋亡的作用。我们用整合素β1的中和抗体来处理细胞，观察Dex对细胞粘附能力的调节作用是否受到影响。CD44也是参与介导细胞与细胞外基质之间的粘附作用的重要粘附分子。因此我们进一步用CD44的中和抗体来阻断CD44的信号通路，观察Dex是否通过CD44增加HO-8910细胞与细胞外基质的粘附。结果表明Dex是通过细胞表面粘附分子的受体增强HO-8910与细胞外基质的粘附能力。整合素与细胞外基质结合后，能通过激活FAK，进一步激活下游的多条信号转导通路。PI-3K-AKT通路是FAK下游的信号转导通路之一。既往的研究表明PI-3K-AKT活化后能保护多种细胞，如上皮细胞、成纤维细胞等免于因紫外线照射、去除培养液中的血清或生长因子以及使贴壁培养的上皮细胞被悬浮等所诱导的细胞凋亡。因此我们首先观察了Dex对FAK活性的影响。我们进一步检测了PI-3K下游的AKT的磷酸化水平。并使用AKT的抑制剂wortmanin观察其是否能阻断Dex促进细胞存活和抗化疗药诱导的凋亡作用。以上结果表明PI-3K/AKT通路介导了Dex对紫杉醇诱导的细胞凋亡的保护作用。本校病理生理教研室之前的研究发现，Dex能明显增强卵巢癌HO-8910细胞和SKOV3细胞与瓶壁的粘附能力。这种作用与Dex上调整合素家族粘附分子的表达有关。但是Dex是否影响卵巢癌细胞ECM成分的表达和分泌还不清楚。Dex增加细胞粘附后，通过激活哪些下游信号转导通路介导Dex抵抗化疗药诱导凋亡的作用也不清楚。本研究在之前研究的基础上，进一步研究了Dex促进卵巢癌细胞粘附的机制和促进卵巢癌细胞在化疗药作用的存活和抗凋亡的机制。本研究不仅有助于进一步阐明GC对卵巢癌细胞增强粘附和促存活抗凋亡的作用机制，还可为临床合理使用化疗药提供理论依据。第一部分地塞米松增强人卵巢癌细胞对化疗药物的抵抗目的：探讨Dex是否抵抗化疗药物顺铂和紫杉醇对卵巢癌细胞（HO-8910、SKOV3）的凋亡作用。方法：首先用MTT法检测了不同浓度顺铂、紫杉醇两种化疗药物单独及联合Dex对卵巢癌HO-8910和SKOV3细胞存活的影响；用Annexin V-FITC单染法，流式细胞仪检测细胞凋亡；用Western blotting的方法进一步检测了活化形式caspase-3蛋白的表达情况；进一步研究了Dex对卵巢癌细胞与细胞外基质粘附能力的影响。结果：（1）顺铂单独作用能显著的以浓度依赖性的方式降低细胞的存活，Dex单独作用也能抑制上述细胞的增殖，但两者合用存活的细胞数却较单独顺铂组明显增加。另外的一种用于卵巢癌治疗的化疗药物紫杉醇与Dex联用也能使HO-8910和SKOV3细胞系存活的细胞数较单用紫杉醇组明显增多。（2）流式细胞仪检测细胞凋亡，结果发现2μg/ml顺铂处理HO-8910细胞，凋亡细胞数约占总细胞数的18.38%（P<0.05），顺铂联合Dex处理组，其凋亡细胞数下降到总细胞数的10.1%（P<0.01）。（3）在HO-8910细胞中，顺铂能显著诱导活化的caspase-3的表达，而Dex能够明显抑制顺铂对活化的caspase-3表达的诱导作用。证明了Dex是通过抑制了化疗药物对HO-8910细胞的促凋亡作用来增强细胞的活性的。（4）Dex能够以时间依赖的方式显著增强HO-8910和SKOV3细胞在FN包被的培养板中的粘附能力。结论：Dex能减轻化疗药物对卵巢癌细胞的杀伤作用。Dex是通过抑制了化疗药物对HO-8910细胞的促凋亡作用来增强细胞的活性的。Dex增强了卵巢癌细胞与细胞外基质的粘附能力。第二部分地塞米松增强人卵巢癌细胞对化疗药物抵抗机制的研究目的：探讨地塞米松增强人卵巢癌细胞对化疗药物抵抗机制的研究。方法：设计用Dex处理不同时间点对HO-8910细胞ECM成分表达与分泌的影响。100nM Dex处理HO-8910细胞0～48h，realtime-PCR检测mRNA的表达，ELISA检测蛋白的分泌；整合素β1的中和抗体处理细胞后，用MTT法检测了Dex促进细胞存活和抗化疗药诱导的凋亡作用的影响；我们用Western Blot的方法检测了Dex对FAK磷酸化水平的影响；进一步检测了PI-3K下游的AKT的磷酸化水平；使用AKT的抑制剂wortmanin观察其是否能阻断Dex促进细胞存活和抗化疗药诱导的凋亡作用。结果：（1）Dex处理组细胞与对照细胞相比，I型、III型和IV型胶原和层粘连蛋白mRNA的表达无明显差别，层粘连蛋白和透明质酸的分泌也无明显改变。纤连蛋白mRNA的表达略上调，约为对照的1.72倍。以上结果表明在HO-8910细胞中，Dex增强细胞粘附作用可能并非通过改变细胞外基质的成分来实现的。（2）整合素β1中和抗体能够部分阻断Dex所诱导的细胞与基质间的粘附，且随着中和抗体浓度的增高阻断作用更强。20μg/ml的整合素β1中和抗体可以使粘附的细胞数比Dex单独处理组降低27.3％(p<0.05)。这个结果表明整合素β1亚族介导了Dex对HO-8910细胞粘附能力的增强作用。（3）进一步观察了整合素β1的中和抗体处理细胞后，Dex促进细胞存活和抗化疗药诱导的凋亡作用的影响，结果显示，整合素β1中和抗体能够降低Dex对顺铂诱导的细胞凋亡的保护作用。20μg/ml的整合素β1中和抗体可以减低Dex对顺铂的保护作用，使存活的细胞数为Dex单独处理组的61.5％(p<0.05)。（4）CD44中和抗体能够部分阻断Dex所诱导的细胞与FN之间的粘附，且随着中和抗体浓度的增高阻断作用更强。40μg/ml的CD44中和抗体可以使Dex处理组粘附的细胞数比单独Dex处理组降低26.5％(p<0.05)。（5）100nMDex处理HO-8910细胞20min，细胞中FAK的磷酸化水平即开始增高，40min时达最高峰，60min时回落至对照水平，总的FAK蛋白表达水平无明显变化，表明Dex可以快速激活FAK。在SKOV3细胞中100nM Dex处理细胞10min，细胞中FAK的磷酸化水平即开始增高，60min时达最高峰。（6）100nM Dex处理细胞0~36h，westernblotting结果显示，Dex能使HO-8910和SKOV3细胞中磷酸化的AKT蛋白明显增多，100nM Dex处理HO-8910细胞8h，细胞中AKT的磷酸化水平即开始增高，12小时达高峰，持续到36小时仍然无明显降低，总的AKT蛋白表达水平无明显变化，表明Dex可以激活AKT。相似的结果也在SKOV3细胞中得到证实。（7）使用AKT的抑制剂wortmanin观察其是否能阻断Dex促进细胞存活和抗化疗药诱导的凋亡作用。100nM Dex具有保护细胞抗紫杉醇诱导细胞凋亡的作用，使得存活细胞数较单独紫杉醇组增加约50%，而PI-3K/AKT抑制剂wortmanin能够逆转Dex的此种保护作用，使得存活细胞数回到单用紫杉醇的水平结论：在HO-8910细胞中，Dex增强细胞粘附作用可能并非通过改变细胞外基质的成分来实现的。粘附分子介导了Dex增强卵巢癌细胞与细胞外基质的粘附参与了Dex的抗凋亡作用。激活粘附斑激酶和PI-3K-Akt通路参与了Dex的抗凋亡作用。