论文部分内容阅读
目的:牵张成骨（distraction osteogenesis,DO）又被称为牵引成骨或骨痂延长术,其过程为对目标骨进行低能量截骨术,后对带血管蒂的骨块施加持续的牵张力,最终可见牵张间隙中有新骨形成。这是一种骨的内源性组织工程学技术。除了骨的新生,血管的新生与生成过程对于牵张成骨技术的成功同样必不可少。此外,牵张成骨的新骨生成速率可达儿童期自然生长率的4～6倍,这可能是牵张成骨引起的局部返祖现象所导致的。热休克蛋白20（heat shock protein 20,Hsp20）是一种小热休克蛋白分子,其在人体内有着广泛的表达,其中骨骼、心脏、平滑肌中含量较高。本课题组前期通过高通量测序技术探究成年犬牵张成骨区、胚胎期犬下颌骨m RNA表达的不同,发现Hsp20在两组中皆显著高表达,我们推测Hsp20对牵张成骨过程中的血管新生产生着一定的影响,故在此研究中,我们在体外试验中通过运用含不同浓度氯化钴（CoCl2）的培养基模拟缺氧微环境模型,培养犬骨髓来源的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,研究适宜浓度的CoCl2是否会对EPCs的功能产生影响,是否会导致Hsp20表达的增高,并初步探讨此过程与PI3K/Akt信号通路的相关性,为进一步在体内实验研究Hsp20对牵张成骨过程中的血管新生过程的影响奠定基础。方法:1、犬EPCs的分离培养、功能鉴定及对CoCl2模拟缺氧微环境对EPCs的影响:首先运用密度梯度离心法结合差速贴壁法对犬EPCs进行分离培养,运用免疫荧光鉴定EPCs,迁移实验检测EPCs的迁移功能,成管实验检测EPCs的成管能力;CCK-8增殖实验检测不同浓度CoCl2对EPCs增殖的影响;细胞周期实验检测不同浓度CoCl2对EPCs细胞周期的影响;凋亡实验检测不同浓度CoCl2对EPCs凋亡的影响;细胞迁移实验检测不同浓度CoCl2对EPCs迁移能力的影响;成管实验检测不同浓度CoCl2对EPCs成管能力的影响;免疫荧光检测不同浓度CoCl2对EPCs表达Hsp20能力的影响;RT-qPCR检测不同浓度CoCl2对EPCs中HIF-1α、Hsp20、KDR、PI3K、Akt转录水平表达的影响;Western Blot检测不同浓度CoCl2对EPCs中HIF-1α、Hsp20、KDR、PI3Kp110、t-Akt、p-Akt蛋白水平表达的影响。2、Hsp20对EPCs的影响与PI3K/Akt信号通路的关系:构建过表达及沉默Hsp20的慢病毒载体并进行转染实验,CCK-8增殖实验检测过表达及沉默Hsp20对EPCs增殖的影响;细胞周期实验检测过表达及沉默Hsp20对EPCs细胞周期的影响;凋亡实验检测过表达及沉默Hsp20对EPCs凋亡的影响;细胞迁移实验检测过表达及沉默Hsp20对EPCs迁移能力的影响;成管实验检测过表达及沉默Hsp20对EPCs成管能力的影响;免疫荧光检测过表达及沉默Hsp20对EPCs表达Hsp20能力的影响;RT-qPCR检测过表达及沉默Hsp20对EPCs中Hsp20、KDR、PI3K、Akt转录水平表达的影响;Western Blot检测过表达及沉默Hsp20对EPCs中Hsp20、KDR、PI3Kp110、t-Akt、p-Akt蛋白水平表达的影响。结果:1、犬EPCs的分离培养、功能鉴定及CoCl2对EPCs的影响:倒置显微镜下观察到原代时EPCs成簇生长,刚贴壁时呈圆形,后来呈长梭形、多角形、纺锤形;免疫荧光结果显示EPCs表达Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1;细胞迁移实验结果显示24h后可见细胞迁移,48h后可见迁移增多;基质胶成管实验结果显示6h后可见EPCs在基质胶中形成“管腔”样结构;CCK-8增殖实验结果显示CoCl2浓度为0.1mmol/L时可促进EPCs增殖（P<0.001）,为0.2mmol/L时先促进（P0.05）、进而抑制（P<0.005）,为0.5mmol/L时,则会对EPCs的增殖产生明显抑制（P<0.001）;细胞周期实验结果显示0.1mmol/L的CoCl2可促进EPCs S+G2期细胞增多（P<0.001）;凋亡实验结果显示0.1mmol/L的CoCl2可抑制EPCs凋亡（P<0.005）;细胞迁移实验结果显示0.1mmol/L的CoCl2可促进EPCs的迁移（P<0.005）;成管实验结果显示0.1mmol/L的CoCl2可促进EPCs的成管（P<0.005）;免疫荧光结果显示0.1mmol/L的CoCl2可促进EPCs于胞内表达Hsp20（P<0.001）;RT-qPCR结果显示0.1mmol/L的CoCl2可上调EPCs中HIF-1α、Hsp20、KDR、PI3K转录水平的表达（P0.05）;Western Blot结果显示0.1mmol/L的CoCl2可上调EPCs中HIF-1α、Hsp20、KDR、PI3Kp110、p-Akt蛋白水平的表达（P0.05）。2、Hsp20对EPCs影响与PI3K/Akt信号通路的关系:慢病毒感染实验结果证明MOI为60且添加P液时转染效率最高;CCK-8增殖实验结果显示过表达Hsp20可促进EPCs增殖（P<0.001）,反之抑制（P<0.001）;细胞周期实验结果显示过表达Hsp20可促进EPCs S+G2期细胞增多（P<0.001）,反之减少（P<0.001）;凋亡实验结果显示过表达Hsp20可抑制EPCs凋亡（P<0.001）,反之促进（P<0.05）;细胞迁移实验结果显示过表达Hsp20可促进EPCs的迁移（P<0.001）,反之抑制（P<0.001）;成管实验结果显示过表达Hsp20可促进EPCs的成管（P<0.001）,反之抑制（P<0.05）;免疫荧光结果显示过表达Hsp20可促进EPCs于胞内表达Hsp20（P<0.001）,反之抑制（P<0.001）;RT-qPCR结果显示过表达Hsp20可上调EPCs中Hsp20、KDR、PI3K转录水平的表达（P<0.001）,反之下调（P0.05）;Western Blot结果显示过表达Hsp20可上调EPCs中Hsp20、KDR、PI3Kp110、p-Akt蛋白水平的表达（P<0.05）,反之下调（P0.05）。结论:1、适宜浓度的CoCl2可模拟缺氧微环境进而促进犬EPCs的增殖、迁移、成管能力及HIF-1α、Hsp20、KDR、PI3K的表达,并使得p-Akt比例增多;2、Hsp20增强犬EPCs的各项生物功能至少部分上与PI3K/Akt信号通路的激活有关。