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第一部分肿瘤细胞CD47的表达和肿瘤浸润性巨噬细胞的数量是影响胰腺癌病人预后的独立因素目的:探讨胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）肿瘤组织中CD47表达与PD-L1表达及巨噬细胞浸润数量之间的关系,明确这些指标与PDAC病人临床病理特征和预后的关系。方法:使用抗CD47抗体、抗PD-L1抗体、抗CD68抗体和抗CD163抗体对106例PDAC病人的肿瘤组织切片进行免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色。Spearman’s秩相关分析各个变量之间的关联。单因素和多因素Cox分析及Kaplan-Meier分析评估病人预后。结果:IHC染色显示肿瘤组织高表达CD47和PD-L1的病例分别占所有病例的61.3%和30.2%。CD68+巨噬细胞（Macrophages,M）和CD163+M2型巨噬细胞高浸润（M2 macrophages,M2）的病例分别占所有病例的48.1%和42.5%。相关性分析发现CD68+M和CD163+M2的浸润数量呈正相关,CD68+M数量与CD47的表达亦成显著正相关,而CD163+M2与CD47表达之间不存在相关性。CD163+M2高浸润则与更高的T分期相关;而CD68+M和CD47表达均与临床病理变量无明显相关性。单变量和多变量分析均表明肿瘤中CD47的表达是影响PDAC病人预后的独立危险因素。进一步对CD47、PD-L1、CD68、CD163四个指标的高低表达进行两两联合分析,我们发现CD47high/CD68+Mhigh、CD47high/CD163+M2high、CD47low/CD68+Mlow、CD47low/CD163+M2low是影响PDAC病人预后的独立因素。结论:在PDAC病人中,肿瘤细胞CD47的表达与肿瘤组织浸润的巨噬细胞数量具有显著相关性,并且是影响病人预后的独立危险因素。第二部分单细胞RNA测序揭示抗CD47免疫疗法诱导胰腺癌肿瘤浸润性免疫细胞的重构目的:探讨抗-CD47单克隆抗体（Monoclonal antibody,m Ab）在胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）小鼠模型中的抗肿瘤作用及作用机制。方法:建立PDAC人源化肿瘤模型（Patient-derived xenograft,PDX）,观察抗-CD47 m Ab对胰腺癌的作用;进一步采用小鼠胰腺癌细胞株Panc02在C57BL/6小鼠皮下成瘤构建同源性小鼠胰腺癌模型,采用抗-CD47 m Ab干预,观察抗肿瘤效果;为了探讨抗-CD47 m Ab治疗的作用机制,我们在Panc02小鼠胰腺癌模型使用抗-CD47 m Ab治疗后的第15天,将治疗组和未治疗组（对照组）的肿瘤解剖取下,分离酶解为单细胞悬液,分选CD45+免疫细胞进行单细胞RNA测序（基于10X Genomics平台）。结果:胰腺癌PDX模型在抗-CD47 m Ab治疗后,肿瘤负荷的降低并无统计学差异,可能与PDX模型是由免疫缺陷鼠构建有关,其缺乏完整的免疫系统。我们进一步构建了拥有完整免疫系统的Panc02小鼠胰腺癌模型,我们发现在抗-CD47m Ab治疗后,小鼠肿瘤的生长显著下降。并进一步通过单细胞测序检测了22608个肿瘤浸润免疫性细胞,分群情况如下:8个淋巴细胞亚群、5个单核/巨噬细胞亚群、3个中性粒细胞亚群以及3个树突状细胞亚群。我们发现抗-CD47 m Ab治疗后,显著增加了肿瘤组织中CD4+T细胞的浸润;改变了肿瘤浸润性Tregs细胞亚群的构成;改变了肿瘤浸润性CD8+T细胞各个亚群的数量、比例及基因表达水平,诱导这些CD8+T细胞更加活化;并且重构了肿瘤浸润性巨噬细胞亚群的组成,促进M2型巨噬细胞向具有抗肿瘤作用的M1型巨噬细胞进行转化。结论:抗-CD47 m Ab治疗能抑制小鼠胰腺癌的肿瘤生长,并且重构肿瘤中浸润性免疫细胞亚群的比例,促进M2型巨噬细胞向M1型转化,从而起到改善肿瘤免疫微环境和杀伤肿瘤细胞的作用。第三部分抗CD47联合抗PD-L1疗法在小鼠胰腺癌模型中的抗肿瘤作用及作用机制目的:探讨以CD47和PD-L1为靶点的联合免疫治疗对小鼠胰腺癌的抗肿瘤效应及其作用机制。方法:收集Panc02和MPC-83细胞悬液,分别于C57BL/6小鼠和KM小鼠右侧腹背部皮下注射,建立Panc02和MC-83小鼠胰腺癌模型。肿瘤体积达到50～100mm~3时,小鼠被随机分成4组（每组5只）:对照组、抗-CD47抗体治疗组、抗-PD-L1抗体治疗组、抗-CD47联合抗-PD-L1抗体治疗组。对照组使用鼠源Ig G腹腔注射;治疗组采用相应抗体治疗2周。治疗结束后,小鼠被安乐死,将肿瘤取下并进行测量记录;采用流式细胞术和RNA测序对各组小鼠的免疫细胞进行检测。结果:我们观察到抗-CD47和抗-PD-L1联合治疗对MPC-83小鼠的肿瘤生长有协同抑制作用,而对Panc02模型无协同抑制作用。在MPC-83小鼠模型中,相比抗-CD47抗体或抗-PD-L1抗体单药治疗,联合治疗显著提高了小鼠脾脏和肿瘤组织中PD-1+CD8+T细胞的比例,并且提高了肿瘤浸润性免疫细胞中Cd8b1,Pdcd1,Arg1,Lag3,Nos2,Mrc1,Serpinb9和Ifit3等免疫细胞活化基因的表达水平,然而这些发现在Panc02小鼠模型中没有观察到。结论:我们的研究表明,联合靶向CD47和PD-L1对MPC-83小鼠的肿瘤生长有协同抑制作用,但对Panc02小鼠模型的肿瘤生长无协同抑制作用,这可能是由于不同胰腺癌细胞株所建立的不同的肿瘤微环境所造成。