肺炎是儿童和老人的常见病、多发病,占儿童门诊和住院病人第一位。肺炎的死亡率很高,是发展中国家儿童死亡病例中致死性最高的疾病。细菌性肺炎在肺炎中的比例很高,肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌是细菌性肺炎的第一和第二大病原菌。肺炎链球菌可以引起一系列高发病率和致死率的传染性疾病。全世界范围内,每年有大约160万人死于肺炎链球菌感染引发的疾病,其中大约120万是婴幼儿。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界中,除了肺炎以外,还可以引起皮肤感染、菌血症等多种疾病。金黄色葡萄球菌已经成为外科手术感染的头号致病细菌。目前,治疗肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌感染性疾病的主要手段是使用抗生素。但是近年来,由于细菌对抗生素的耐药性越来越强,抗生素的效果已经越来越弱。接种疫苗是一种最高效的、简易可行的预防肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌疾病发病的方法。目前还没有市售的金黄色葡萄球菌疫苗。有二种肺炎链球菌疫苗已经上市。第一种是23价肺炎链球菌多糖疫苗。由于肺炎球菌多糖是非T细胞依赖性抗原,用其制备的疫苗免疫一针可诱导机体产生保护水平的抗体,但其不能诱导免疫记忆;最重要的是23价肺炎链球菌多糖疫苗对两岁以下的婴幼儿保护效果不理想,而这一群体是肺炎链球菌疾病的高发人群。第二种是蛋白—多糖结合疫苗。该疫苗是目前美国FDA指定唯一看用于预防两岁以下婴幼儿肺炎链球菌疾病的疫苗;但是,该疫苗也存在一些问题,主要是疫苗保护作用覆盖的血清型少;制备过程工艺复杂导致了生产成本和销售价格高昂,这大大限制了该疫苗在发展中国家的应用。为解决上述问题,使用在多种血清型肺炎链球菌中高度保守的蛋白质作为疫苗抗原的设计思想被提出。当前,肺炎链球菌的许多抗原被发现具有保护作用,如:肺炎链球菌溶血素（Pneumolysin,Ply）、肺炎球菌粘附素A（Pneumococcal surface adhesin A,PsaA）、B 群链球菌细胞壁分离所需蛋白（Protein Required for Cell Wall Separation of Group B Streptococcus,PcsB）、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Serine/Threonineprotein Kinase,StkP）等。α-溶血素（α-hemolysin,Hla）和铁调节表面决定蛋白B（Iron responsive surface determinant B,IsdB）在金黄色葡萄球菌感染宿主和在宿主体内繁殖的过程中发挥重要作用。同时,这两个蛋白也是金葡菌疫苗研究的新型蛋白抗原。上述蛋白在小鼠免疫攻毒实验中,表现出很好的保护力,被认为是非常理想的候选疫苗抗原。本研究旨在研究开发新型的肺炎链球菌疫苗和金黄色葡萄球菌疫苗,并通过一定的免疫策略,单独或联合使用蛋白疫苗抗原,以获得广谱的、有效的保护力。本研究主要分为以下几个部分:第一,本研究从天然肺炎链球菌毒株中扩增得到相关蛋白的核苷酸序列,通过序列比对,选取Ply、PsaA、PcsB和StkP这四种高度保守、并且对肺炎链球菌生存和感染过程十分重要的肺炎链球菌蛋白作为肺炎链球菌疫苗的候选抗原。通过序列比对,选取Hla和IsdB两种蛋白作为金黄色葡萄球菌蛋白疫苗的候选抗原。第二,本研究对Ply、PcsB、StkP、Hla和IsdB四种蛋白的天然氨基酸序列进行修饰。其中,野生型Ply和Hla有溶血毒性,不能直接作为疫苗的抗原组分;所以本研究在其天然氨基酸序列上对关键的氨基酸突变,获得可以应用于疫苗的减毒蛋白。对蛋白PcsB、StkP和IsdB的全长序列截短,获得更高效表达的截短型蛋白。第三,优化候选蛋白的核苷酸序列使之更适应大肠杆菌表达系统,合成基因片段。构建了一系列原核表达质粒。通过大肠杆菌原核表达系统高效表达蛋白并提纯,利用WesternBlot等检测手段对获得的蛋白进行特异性检测。第四,本研究通过体外保护实验和动物免疫攻毒保护实验评价制备出的疫苗抗原的免疫保护能力。实验结果表明,本研究所制备的蛋白抗原及其部分组合可以对肺炎链球菌毒株的致死性攻击提供有效的保护,这种保护有广谱性的趋势。综上所述,本研究成功制备了高度保守的肺炎链球菌蛋白疫苗抗原和金黄色葡萄球菌蛋白疫苗抗原,这些蛋白抗原单独或联合作为疫苗使用可以针对肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌的致死性攻击产生有效的保护。