目的肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae, S.pn)作为最重要的人类病原菌之一能够引起危及生命的侵袭性疾病,尤其是在老人和小孩中。其造成的死亡在美国及欧洲是所有能够用疫苗预防疾病中最高的,而在世界范围内绝大多数的死亡是发生在发展中国家。由于耐药问题的愈发严重,疫苗已经成为防治S.pn的重点。锌金属蛋白酶(Zinc metalloprotease B, ZmpB)存在于所有分离出的肺炎链球菌中[15],其作为一个毒力因子能够诱导下呼吸道肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生。用基因展示技术发现ZmpB的抗原位点能够与77%的成人血清反应,高于PspA的60%。这些结果提示ZmpB可能是肺炎链球菌一个良好的新疫苗靶点。肺炎链球菌DnaJ(HSP40)作为热休克蛋白之一,具有高度的保守性,用粘膜以及腹腔免疫后均能够抵御多种肺炎链球菌的攻击。肺炎链球菌溶血素(Ply)是近年来广泛研究的候选疫苗蛋白,其无溶血活性突变体ΔA146 Ply能针对肺炎链球菌感染产生良好的保护作用。本文拟在评价ZmpB作为疫苗候选蛋白的潜力的基础上,进一步研究其与DnaJ、Ply联合后的保护效果。方法在大肠杆菌中进行克隆和表达ZmpB重组蛋白(保守区段),免疫BALB/C小鼠得到抗ZmpB的多克隆抗体。通过Western blot鉴定ZmpB在不同肺炎链球菌菌株中的表达情况;评价ZmpB蛋白以及抗ZmpB多抗对于S.pn介导的A549细胞粘附的影响;ELISA方法检测免疫后血清中的抗体亚型以及脾细胞培养上清中细胞因子分泌情况。对ZmpB、DnaJ、ΔA146 Ply单个蛋白粘膜免疫后小鼠用不同菌株进行定植实验以及生存率的评价。并对ZmpB、DnaJ、ΔA146 Ply单一或联合通过腹腔途径免疫小鼠,通过鼻腔和腹腔两种攻毒方式分别评价其抵挡S.pn定植和抵抗S.pn引起败血症感染的能力,并利用各组特异性的抗血清进行被动免疫保护实验的评价。结果本研究成功表达了包含成熟ZmpB蛋白15到590氨基酸的多肽,其纯度>90%。Western Blot鉴定发现抗ZmpB多克隆抗体能够与2型,3型,6B,14以及19F型的肺炎链球菌裂解物反应,其反应区带大约在210Kda(ZmpB全长蛋白分子量)处。无论是ZmpB的重组蛋白还是抗ZmpB的多抗都能够有效抑制肺炎链球菌与A549细胞的粘附作用。粘膜免疫ZmpB后能够刺激小鼠脾细胞产生高水平的IL-10、IFN-γ和IL-17A,并刺激小鼠产生以IgG1为主抗体亚型;并能够显著降低19F以及14型肺炎链球菌在肺部的定植,提高2型,3型,6B以及14型菌攻毒后小鼠的生存时间。用重组ZmpB与DnaJ和ΔA146 Ply进行联合的腹腔免疫,与单个蛋白免疫相比能够显著提高对肺炎链球菌感染的保护力(p<0.05);被动免疫实验同样证明了用这三种蛋白联合免疫后得到的高免疫状态的抗血清得到的保护效果好于单个抗血清(p<0.05)。结论ZmpB在5种血清型肺炎链球菌株中均有表达,腹腔和粘膜免疫重组ZmpB均能够抵抗多种肺炎链球菌的感染。因此, ZmpB是一个肺炎链球菌蛋白疫苗的良好候选抗原。ZmpB与DnaJ、Ply联合使用后能够产生一定的协同作用,使保护效果显著提高。