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第一部分PFKFB3在肝细胞癌中的表达及临床意义[目的]肝细胞癌几十年来一直是一个世界性的公共卫生问题。该病早期诊断困难,现有的治疗方法大多不能令人满意。PFKFB3在部分癌症中上调,但其在HCC中的作用尚不清楚。因此,本研究旨在探讨PFKFB3在HCC患者中的表达及其在判断HCC患者预后中的作用。[方法]利用生物信息学工具我们从公共数据库中提取并分析了 HCC患者的PFKFB3 mRNA数据进行预后分析和临床病理因素相关性分析。我们还通过对89例肝癌患者肝组织和瘤周组织的免疫组化检测来评估PFKFB3的表达与预后及临床病理因素间关系。[结果]肝癌组织中PFKFB3 mRNA表达水平低于其他肿瘤组织。女性患者PFKFB3 mRNA水平高于男性患者（P=0.03）。PFKFB3 mRNA水平在年龄、体重、肿瘤分级、淋巴结转移情况等方面无显著差异。免疫组化结果显示,血清AFP水平较高（P=0.004）和肿瘤体积较大（P=0.029）与PFKFB3高表达有关。PFKFB3 mRNA和蛋白表达水平上调时患者的总生存期（Overall survival,OS）和无病生存期（Disease-free survival,DFS）将缩短（P<0.05）。[结论]我们的数据表明PFKFB3在HCC中的表达是OS和DFS的独立预后因素。第二部分PFKFB3对HCC增殖、侵袭、迁移能力的影响及机制[目的]PFKFB3对HCC恶性生物学行为的影响及调控机制尚不明确,本部分主要设计探究PFKFB3的表达水平在细胞及体内环境下对HCC增殖、侵袭、迁移能力的影响及机制。[方法]本部分首先通过生物学技术筛选出与PFKFB3表达相关的分子及通路。通过质粒转染调控PFKFB3的表达水平并利用Edu染色检测调控后HCC细胞增殖表型,transwell侵袭实验检测调控后HCC细胞侵袭能力,利用细胞迁移实验检测调控后HCC细胞的迁移能力,检测了体外环境下PFKFB3表达水平变化对HCC增殖、侵袭、迁移能力的影响。利用慢病毒转染技术,构建了 PFKFB3表达上调的HCC细胞系并进行了动物实验,研究体内环境下PFKFB3对HCC增殖及转移能力的影响。利用RT-PCR技术、Western Blot技术、IHC染色等,检测了PFKFB3表达水平与MMP家族成员间关系。[结果]生物信息学数据显示,PFKFB3表达水平与多个促肿瘤基因存在正相关关系,且与胞外基质（Extracellular matrix,ECM）相互作用过程密切相关,在临床患者中PFKFB3的表达水平与MMP家族多个分子呈正相关关系。体外环境下,上调PFKFB3的表达水平可以增强HCC细胞增殖、侵袭、迁移能力,而干扰PFKFB3的表达,将抑制HCC细胞的增殖、侵袭、迁移能力。体内环境下,当PFKFB3表达增高时,肿瘤的增殖能力及转移能力均显著增强。PFKFB3的表达水平改变在mRNA及蛋白水平上均可以引起MMP家族中多个表达水平的正相关改变。[结论]PFKFB3在HCC中扮演了促肿瘤的角色,PFKFB3表达增高能够引起HCC增殖、侵袭、迁移能力增强。MMP家族多个明星分子是PFKFB3的下游靶点,PFKFB3可能通过调节MMP家族成员表达,调控肿瘤的增殖、侵袭和迁移能力。第三部分PFKFB3在HCC细胞中对仑伐替尼耐药性的影响及机制[目的]本部分主要设计探究PFKFB3的表达水平在细胞及体内环境下对肝细胞癌生物学行为的影响及机制。临床实践中,靶向药物耐药是限制靶向药物疗效的主要原因。我们发现PFKFB3表达上调可能是引起仑伐替尼耐药的原因,因此设计实验研究了 PFKFB3表达水平与HCC中仑伐替尼耐药之间的关系。[方法]利用小梯度浓度递增法构建耐仑伐替尼的的HCC细胞系。利用测序技术筛选出耐药基因PFKFB3。利用克隆形成实验、transwell侵袭实验、划痕实验,检测耐药HCC细胞的增殖、侵袭、迁移能力。CCK8实验检测改变PFKFB3表达水平后HCC细胞对仑伐替尼敏感性变化。RT-PCR及Western Blot检测PFKFB3及其下游的MMPs在耐药细胞中表达水平变化。流式凋亡实验检测不同给药条件下耐仑伐替尼HCC细胞的凋亡水平,RT-PCR和Western Blot,IHC检测不同治疗方案处理后PFKFB3及MMPs的表达变化。皮下移植瘤实验研究在体条件下不同治疗方案对仑伐替尼耐药HCC细胞的抑制水平。[结果]PFKFB3及其下游的MMP家族多个成员在耐仑伐替尼的HCC细胞中表达增高,且能够引起耐药细胞增殖、侵袭、迁移能力上调。PFKFB3表达增高可引起HCC对仑伐替尼敏感性降低。联合使用PFKFB3抑制剂能够在体内和体外环境下,抑制PFKFB3及下游MMP家族成员的在RNA及蛋白水平的表达,抑制耐仑伐替尼的HCC细胞增殖。[结论]PFKFB3表达上调能够引起HCC细胞对仑伐替尼耐药。仑伐替尼耐药后,联合使用PFKFB3抑制剂可以抑制PFKFB3及MMPs的表达,逆转HCC细胞对仑伐替尼的耐药性。