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MicroRNAs (miRNAs)是一类大约由22-23个核苷酸组成的具有调控功能的非编码小分子RNA,其主要在转录后水平调控基因的表达,通过与mRNA的3’-UTRs结合而发挥调控作用。越来越多的研究表明miRNAs可以调控人类超过百分之五十的编码基因的表达,这就使得它在包括器官发育、细胞增殖、分化、凋亡等的生理和发育过程中发挥着巨大的作用。miRNAs参与了包括肿瘤在内的许多疾病的过程,他们通常在肿瘤中是表达下调的,抑制某些miRNAs的表达会导致肿瘤的发生。这种类型的miRNAs通常发挥着抑瘤基因的作用,当然,miRNAs也可以发挥瘤基因的作用。例如,小部分的miRNAs在肿瘤中高表达并且发挥着瘤基因的作用(如：miR-17-92, miR-155),大多数的miRNAs在肿瘤中低表达并且发挥着抑瘤基因的作用(如：Let-7, miR-15/miR-16, miR-1/miR-206, miR-29, miR-124, miR-143/miR-145)。研究表明,下调一个发挥瘤基因作用的miRNA可以导致某些抑瘤基因的重新表达,而重新表达一个具有抑瘤基因作用的miRNAs可以下调很多瘤基因的表达。miRNAs调控着下游一大簇基因的表达及信号通路,其最终的作用取决于其所有调控基因的总效应。可见miRNAs的功能是复杂的,目前miRNAs在肿瘤很多方面的作用仍然是不清楚的。miR-26a位于人类3号染色体上,全长21个核苷酸,在多种组织泛表达,其表达无特异性。大量的研究表明,miR-26a抑制鼻咽癌、乳腺癌、肝癌细胞的增殖,但却促进胶质瘤细胞的增殖。有趣的是miR-26a抑制急性髓细胞样白血病的增殖,却促进急性T淋巴细胞白血病的增殖。这些有争议的结论表明,miR-26a可能在不同的肿瘤和不同的组织学类型中发挥着不同的作用,其功能的复杂程度是毋庸置疑的。肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)恶性程度极高,预后极差,全世界约半数HCC患者集中在中国,我国每年约有11万人死于HCC。早期诊断难、复发转移率高是HCC治疗中面临的重要问题。我们通过收集大量HCC组织标本和癌旁非肿瘤组织标本,通过荧光定量PCR的方法分别检测了HCC组织与癌旁非肿瘤组织和伴有转移的HCC组织与无转移的HCC组织中miR-26a的相对表达情况。结果显示与癌旁非肿瘤组织相比,HCC组织中miR-26a的表达水平明显下调,有趣的是我们发现与无转移的HCC组织相比,伴有转移的HCC组织中miR-26a的表达水平又明显上调。而miR-26a在肿瘤中的作用又是非常复杂和有争议的,有研究表明miR-26a抑制HCC细胞增殖,但其在HCC转移方面的作用未见报道,以上我们发现的miR-26a的表达情况会不会预示着miR-26a促进HCC细胞转移呢?如果是这样,那miR-26a在HCC中就即能抑制增殖又能促进转移。这将促进我们更深入地去认识miRNAs在肿瘤发生、发展过程中更全面的功能。基于miR-26a的研究现状及其在HCC中的表达谱,本课题的研究目的为：明确miR-26a在HCC转移方面的作用并阐明其机制。我们通过上调和下调miR-26a的表达水平明确其对HCC细胞转移的影响,随后进行下游靶基因的筛选和验证,初步探讨miR-26在HCC如上生物学行为中所扮演的角色及其机制,这将为深入理解HCC发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础,为此本课题进行了如下研究：方法：1.HCC细胞株和组织标本中miR-26a的表达谱采用qRT-PCR检测BEL-7402、7721、HepG2、Huh7、Hep3B、Sk-Hep-1和P1c7种HCC细胞株miR-26a的表达谱(以正常肝组织366N作为对照)。收集HCC组织标本和癌旁非肿瘤组织标本,应用qRT-PCR检测miR-26a的表达谱,结果分析运用2-△△Ct方法进行比较。2.建立稳定过表达miR-26a的HCC细胞株利用慢病毒表达载体pLVT-miR-26a生产携带miR-26a的慢病毒,收集病毒上清分别感染HCC细胞株BEL-7402、HepG2和Sk-Hep-1,48-72h后于倒置荧光显微镜下检测EGFP表达以观察感染情况,若感染效率低于90%,应用流式细胞仪分选EGFP+细胞,大量扩增细胞并保种；提取RNA,应用qRT-PCR检测携带有miR-26a转基因的HCC细胞株中miR-26a的表达水平。3.过表达miR-26a对HCC细胞体外迁移、侵袭的影响细胞划痕实验及Transwell小室实验检测细胞迁移能力的改变；Borden小室实验检测细胞侵袭能力的改变。4.利用miR-26a阻遏物下调已稳定过表达miR-26a的HCC细胞中miR-26a的表达后以进一步明确miR-26a的如上功能利用脂质体介导瞬时转染技术将化学合成的miR-26a阻遏物(miR-26a inhibitor)转染至BEL-7402-miR-26a和HepG2-miR-26a中,48h收集细胞并提取RNA,qRT-PCR检测miR-26a表达以评价抑制效果,Transwell小室和Borden小室分别评价下调miR-26a表达水平对细胞迁移和侵袭能力的影响,并用qRT-PCR检测稳定过表达miR-26a及重新下调miR-26a后转移相关基因的表达情况。5.体外、体内验证过表达miR-26a对HCC细胞增殖的影响生长曲线(CCK8法)、平板克隆和细胞周期分别检测体外HCC细胞增殖能力改变；裸鼠皮下成瘤实验检测体内HCC细胞增殖能力改变。结果：1.HCC细胞株和组织标本中miR-26a的表达谱采用qRT-PCR检测BEL-7402、7721、HepG2、Huh7、Hep3B、Sk-Hep-1和P1c7种HCC细胞株miR-26a表达谱(以正常肝组织366N作为对照)。结果显示,miR-26a在以上7株HCC细胞株中的表达水平均显著低于366N(图1-1A)。qRT-PCR检测41例HCC组织和44例癌旁非肿瘤组织中miR-26a的表达,结果显示与癌旁非肿瘤组织相比,HCC组织中miR-26a的表达水平明显下调(图1-1B)。有趣的是我们发现与无转移的HCC组织相比,伴有转移的HCC组织中miR-26a的表达水平又明显上调(图1-1C)。2.建立稳定过表达miR-26a的HCC细胞株慢病毒载体pLVT-miR-26a经测序鉴定,插入片段序列与原始序列一致,明确序列正确(结果未提供)；pLVT-miR-26a经Xba I和BamHI双酶切电泳可见两条带,其大小与理论推测值0.418kb和8.346kb基本相符(图2-1B)；测序和酶切鉴定结果表明,pLVT-miR-26a构建成功。接着制备携带miR-26a和EGFP基因的慢病毒,pLVT-miR-26a与病毒包装质粒共转染293FT细胞,48h后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,证明转染成功(图2-2)。接着利用携带miR-26a的慢病毒感染HCC细胞株,48-72h后于倒置荧光显微镜下通过检测EGFP表达确认感染成功(图2-3),随后提取RNA,qRT-PCR检测证实携带有miR-26a转基因的HCC细胞株中miR-26a表达正常(表2-2和图2-4),差异均具有统计学意义(P<0.05),预示成功构建稳定过表达miR-26a的HCC细胞株。3.过表达miR-26a对HCC细胞体外迁移、侵袭的影响3.1迁移能力细胞划痕实验、Transwell小室实验结果均表明过表达miR-26a后BEL-7402和HepG2体外细胞迁移能力增强(表2-3和图2-5A、B)。3.2侵袭能力Borden小室实验结果显示,过表达miR-26a促进了BEL-7402和HepG2细胞体外侵袭(表2-4和图2-5C)。4.利用miR-26a阻遏物下调已稳定过表达miR-26a的HCC细胞中miR-26a的表达后,细胞迁移、侵袭能力的变化及与转移相关基因表达的变化4.1miR-26a inhibitor下调已稳定过表达miR-26a的HCC细胞中miR-26a的表达利用脂质体介导瞬时转染技术将化学合成的miR-26a阻遏物(miR-26a inhibitor)导入BEL-7402-miR-26a和HepG2-miR-26a中,48h收集细胞并提取RNA, qRT-PCR检测miR-26a的表达,结果显示,miR-26a的抑制效率高达95%以上(表2-5和图2-6)。4.2细胞迁移能力变化Transwell小室实验结果显示,在稳定过表达miR-26a的HCC细胞基础上重新下调miR-26a的表达后,细胞迁移能力下降(表2-6和图2-7A)。4.3细胞侵袭能力变化Borden小室实验结果显示,在稳定过表达miR-26a的HCC细胞基础上重新下调miR-26a表达后,细胞侵袭能力减弱(表2-7和图2-7B)。4.4与转移相关基因的变化qRT-PCR检测与转移相关基因(MMP系列基因)的变化显示,BEL-7402和HepG2过表达miR-26a后MMP1、MMP2、MMP9、MMP10表达均上调;在稳定过表达miR-26a的HCC细胞基础上重新下调miR-26a的表达后,MMP1、MMP2、MMP9、MMP10表达均下调。(图2-8)5.体外、体内验证过表达miR-26a对HCC细胞增殖的影响5.1体外验证过表达miR-26a对HCC细胞增殖的影响生长曲线(CCK8法)、平板克隆和细胞周期等实验结果均表明过表达miR-26a可抑制HCC细胞体外增殖(表3-1、2、3和图3-1A、C、D)。而在已稳定过表达miR-26a的HCC细胞上(BEL-7402-miR-26a、HepG2-miR-26a)重新下调miR-26a的表达后,CCK8生长曲线、细胞周期结果提示细胞体外增殖能力增强(表3-4、5和图3-1B、E)。以上实验结果均说明：过表达miR-26a后抑制HCC细胞的体外增殖。5.2体内验证过表达miR-26a对HCC细胞增殖的影响裸鼠皮下成瘤实验结果显示,过表达miR-26a的HepG2细胞所形成的肿瘤明显比对照细胞所形成的肿瘤小(图3-2A、B、C)；将所形成的肿瘤行免疫组化检测BrdU阳性细胞数和p21的表达情况,结果显示：在过表达miR-26a的HepG2细胞所形成的肿瘤中BrdU阳性细胞数明显比对照组的少,而其p21阳性细胞数却明显比对照组的多(表3-6和图3-2D)。以上实验结果均说明：过表达miR-26a后抑制HCC细胞的体内增殖。结论：miR-26a抑制HCC细胞增殖,但促进其迁移及侵袭。