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第一部分PDK1在鼻咽癌细胞和组织中的表达及与患者临床病理特征的关系目的:评估PDK1在人永生化鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞系中的表达水平以及在鼻咽癌组织中的表达情况,并探讨PDK1的表达高低是否与鼻咽癌患者的临床病理特征、预后等相关。方法:采用免疫印迹方法检测人永生化鼻咽上皮细胞系(NP-69)及5种鼻咽癌细胞系(CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、HK1)中PDK1的蛋白质表达水平,并通过相对定量分析比较差异。通过免疫组化方法检测PDK1在鼻咽癌组织中的表达情况,并对PDK1的表达高低与患者的临床病理特征、预后进行相关性分析。结果:相对于NP69细胞,PDK1的蛋白质表达水平在5种鼻咽癌细胞系中显著升高。免疫组化结果提示鼻咽癌组织中的PDK1主要在细胞浆/细胞膜表达。我们的分析结果显示,PDK1表达高低与患者的性别、年龄、临床分期和组织学分型无显著相关性。但是,生存分析结果表明PDK1低表达患者的无进展生存时间显著延长。结论:PDK1在鼻咽癌细胞系中的表达水平显著高于鼻咽上皮细胞系,其在癌组织中高表达是鼻咽癌患者预后不良的预测指标。第二部分PDK1下调对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响目的:探讨PDK1下调在体内外对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。方法:首先,我们通过RNA干扰技术构建PDK1表达下调的鼻咽癌细胞系HK1-shPDK1和CNE2-shPDK1,并使用免疫印迹的方法验证干扰效果。通过克隆形成实验探讨PDK1下调对细胞放射敏感性的影响,并通过免疫荧光检测γ-H2AX焦点阳性数量以评估照射诱导的DNA损伤程度。此外,采用流式细胞技术检测细胞照射后的凋亡率和细胞周期分布。最后,我们通过裸鼠移植瘤模型评估PDK1表达下调在体内对鼻咽癌细胞的增殖和放射敏感性的影响。结果:免疫印迹结果显示,PDK1表达下调的鼻咽癌细胞系HK1-shPDK1和CNE2-shPDK1构建成功。克隆形成实验显示,与单纯照射组相比,在不同剂量照射后,PDK1表达下调细胞系的克隆形成率显著降低。在给予细胞6Gy剂量照射后,与单纯照射组相比,PDK1表达下调组的γ-H2AX焦点阳性数量显著增加。此外,相对于单纯照射组,PDK1表达下调联合照射组的细胞凋亡比例显著增加;PDK1下调联合照射能够减少单纯照射诱导的G2期阻滞,同时显著增加G1期比例。裸鼠移植瘤实验结果显示,与正常对照组相比,PDK1下调并不能抑制肿瘤生长,单纯照射后肿瘤的生长受到明显抑制,而PDK1下调联合照射组的肿瘤生长抑制程度更显著、肿瘤重量也明显降低。结论:PDK1下调能够在体内外水平增强鼻咽癌细胞的放射敏感性。第三部分PDK1下调对鼻咽癌细胞放射增敏的分子机制研究目的:探讨PDK1下调增强鼻咽癌细胞放射敏感性的分子机制。方法:我们通过免疫印迹方法检测细胞照射前后PDK1相关分子的表达变化。此外,我们构建PDK1过表达的细胞系HK1-PDK1-OE,并使用免疫共沉淀的方法探讨PDK1是否与其下游分子存在蛋白质相互作用。结果:免疫印迹结果显示,细胞照射后Akt信号通路被激活,而PDK1下调能够显著降低Akt-Ser308位点的磷酸化水平;同时,mTOR及其下游S6K的磷酸化水平也显著下降;此外,相对于单纯照射组,PDK1下调联合照射组的GSK-3β磷酸化水平显著降低,其下游的β-catenin蛋白水平也相应的下降。随后,我们检测上皮间质转化相关分子的表达情况,结果显示PDK1下调能够增加细胞上皮标志物E-cadherin的水平,并减少间质标志物N-cadherin和Vimentin的水平。最后,免疫共沉淀结果显示,细胞照射前后,在HK1和HK1-PDK1-OE中检测不到PDK1与其下游分子的蛋白质相互作用。结论:PDK1下调通过抑制照射诱导的Akt磷酸化激活及其下游的mTOR/S6K和GSK-3β/β-catenin信号通路,同时逆转细胞上皮间质表型,实现放射增敏效果。第四部分PDK1抑制剂增强放射抵抗鼻咽癌细胞的放射敏感性的初步探讨目的:探讨PDK1抑制剂对具有放射抵抗特性的鼻咽癌细胞的放射敏感性的影响。方法:我们通过间断照射构建具有放射抵抗特性的鼻咽癌细胞系HK1-R和CNE2-R,并使用克隆形成实验验证其放射抵抗的特性。随后,使用免疫印迹方法检测PDK1和上皮间质转化相关分子的表达情况,通过CCK8实验评估PDK1抑制剂(GSK2334470)对鼻咽癌细胞增殖的影响,并使用克隆形成实验评估PDK1抑制剂对细胞放射敏感性的影响。最后,我们使用免疫印迹方法检测PDK1抑制剂联合照射时,细胞凋亡和损伤相关标志物的表达情况。结果:我们构建的HK1-R和CNE2-R细胞系具有放射抵抗的特性。与亲本细胞相比,HK1-R和CNE2-R细胞的上皮标志物E-cadherin的表达下降,间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达升高,而PDK1的表达无显著差异,这提示放射抵抗细胞系具有间质样表型。然而,GSK2334470能够逆转细胞的上皮间质转化。CCK8实验结果显示,GSK2334470能够抑制鼻咽癌的细胞增殖。同时,与单纯照射组相比,药物联合照射组的细胞活力进一步降低,克隆形成率也显著下降。免疫印迹结果显示,GSK2334470对AKT磷酸化的抑制作用呈现药物浓度依赖型;与单纯照射相比,GSK2334470联合照射后细胞的凋亡和损伤相关分子表达上调,提示PDK1抑制剂能够克服细胞放射抵抗的特性。结论:PDK1抑制剂对放射抵抗鼻咽癌细胞系具有放射增敏的效果。