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为检测致病体,哺乳动物的先天免疫系统已发展出独特的传感策略,包括基于DNA识别的中心策略。环磷酸鸟苷-腺苷合成酶(cGAS)可以检测病原体或损伤细胞释放的DNA,刺激其构象发生变化进而诱导其酶活性,从而产生内源性第二信使cGAMP。cGAMP与干扰素基因刺激因子(STING)结合从而活化STING。活化后的STING从内质网经过高尔基体转运至核周,进而激活下游相关信号通路,启动免疫应答。虽然STING对保护宿主抵抗多种DNA病原体至关重要,但是持续的STING激活可导致致命的疾病反应。因此,需要以多层且高度有序的方式动态调节STING信号传导的强度和持续时间,以维持免疫稳态。STING是一种高效抗病毒、抗肿瘤的重要的适应蛋白,其活性受到泛素化的显著调控。与大多数翻译后修饰一样,泛素化是一个可逆的过程,据有关报道哺乳动物基因组编码约100多种不同的去泛素化酶(DUB),其中卵巢肿瘤相关蛋白酶(OTUs)是最新发现的去泛素化酶家族,其OTUD5是家族中非常重要的成员之一,目前报道的为OTUD5可通过去泛素化调控Traf3参与到天然抗病毒免疫中,另外也有文献报道OTUD5可参与调控适应性免疫。目前,对STING的去泛素化修饰的研究还不够深入,报道过的DUB并没有OTUs家族的成员,而且DUB对STING的作用研究还有待系统提高。我们的课题主要对OTU家族的成员进行筛选,确定其功能及机制,进而探究其在天然免疫抗病毒通路中的作用。在本文我们发现OTUD5对STING起到一个K48位的去泛素化作用,能够稳定STING,在DNA病毒信号通路中起到抗病毒的作用。研究目的:探讨OTUD5在DNA病毒天然免疫中的功能与作用机制,并通过小鼠的动物模型实验验证OTUD5的抗病毒作用。试验方法:1.寻找OTUs家族对STING起到去泛素化作用的分子通过外源过表达相关质粒筛选对STING有去泛素化作用的分子,并通过内源去泛素化实验进行验证,结果表明OTUD5对STING起到明显的去泛素化作用。2.探究OTUD5与STING的相互作用外源过表达相关质粒通过免疫共沉淀技术分析OTUD5与STING的相互作用,并通过内源结合实验进一步验证OTUD5与STING的相互作用。3.探究OTUD5对STING稳定性的调节将Myc-STING、Flag-OTUD5与野生型和突变型的泛素质粒转染入293T细胞中,然后检测STING的泛素化。为了进一步验证OTUD5是否能够调节STING的稳定性,我们取Otud5 fl/Y以及Otud5fl/YLyz2-Cre老鼠的原代腹腔细胞,感染HSV-1病毒后检测STING的表达。4.探究OTUD5对天然免疫抗病毒信号通路所介导的细胞因子表达的影响4.1敲低OTUD5后检测下游细胞因子的表达使用适龄的野生型小鼠,获得原代腹腔巨噬细胞,转染siRNA48h后,分别用ISD、HSV-60、cGAMP、LPS刺激,以及SeV、HSV-1感染细胞,提取总RNA,通过试剂盒反转录为cDNA,实时定量PCR检测Ifnb1以及IFN下游相关基因的表达并收取细胞上清,用ELISA检测IFN-β的分泌。4.2敲除OTUD5后检测下游细胞因子的表达取Otud5 fl/Y以及Otud5 fl/Y Lyz2-Cre老鼠的原代腹腔细胞,分别用ISD、HSV-60、cGAMP、LPS 刺激,以及 SeV、VSV、HSV-1 感染细胞,提取总 RNA,通过试剂盒反转录为cDNA,实时定量PCR检测Ifnb1以及IFN下游相关基因的表达。收取上清,用ELISA检测IFN-β的分泌。5.OTUD5对信号通路活化的影响使用8-10周的野生型小鼠,获得原代腹腔巨噬细胞,转染siRNA48h后,分别用 ISD、HSV-60、cGAMP、LPS 刺激,以及 SeV、HSV-1 感染细胞,Western Blotting检测TBK1、IRF3的磷酸化水平。取Otud5 fl/Y以及Otud5 fl/Y Lyz2-Cre老鼠的原代腹腔细胞,分别用ISD、HSV-60、cGAMP、LPS 刺激,以及 SeV、VSV、HSV-1 感染细胞,Western Blotting检测TBK1、IRF3的磷酸化水平。非变性Western Blotting检测IRF3的二聚化情况。6.OTUD5对病毒复制的影响取Otud5 fl/Y以及Otud5 fl/Y Lyz2-Cre老鼠的原代腹腔细胞,用VSV、HSV-1感染细胞,实时定量PCR检测Ifnb1mRNA水平以及病毒mRNA的水平变化。取Otud5 fl/Y以及Otud5 fl/Y Lyz2-Cre老鼠,腹腔注射HSV-1,取小鼠的脑组织研磨,通过实时定量PCR检测病毒基因组DNA拷贝数;通过小鼠致死实验检测生存率;病毒空斑实验检测HSV-1病毒的复制情况。实验结果:1.OTUD5对STING起到明显的去泛素化作用通过外源过表达相关质粒筛选到OTUD5对STING起到明显的去泛素作用,而OTUs家族其它分子并没有对STING起到去泛素化作用。将OTUD5的酶活位点突变掉成C224S,OTUD5对STING的去泛素化作用消失。使用适龄的野生型小鼠,获得原代腹腔巨噬细胞,转染siRNA48h后,HSV-1感染细胞,通过内源去泛素化作用,在干扰OTUD5后,HSV-1刺激使STING泛素化水平明显升高,得出相同的结果。2.OTUD5与STING相互作用通过免疫共沉淀实验证明OTUD5与STING存在相互结合,将OTUD5的酶活位点突变成C224S并没有影响OTUD5与STING的相互作用。3.OTUD5能够调节STING的稳定性将Myc-STING、Flag-OTUD5与野生型和突变型的泛素质粒转染入293T细胞中,可以发现OTUD5对STING起到K48位的去泛素化作用,通过外源以及内源检测,OTUD5对STING都起到稳定的作用。4.敲低OTUD5后下调DNA信号通路下游细胞因子的表达使用适龄的C57BL/6小鼠,获得原代腹腔巨噬细胞,转染siRNA48h后,分别用ISD、HSV-60、cGAMP刺激,HSV-1感染细胞,实时定量PCR检测下游细胞因子mRNA水平变化。结果显示,在干扰掉OTUD5后,ISD、HSV-60、cGAMP刺激,以及HSV-1感染所介导的Ifnb1mRNA水平明显下降,这表明OTUD5正向调控DNA信号通路介导的IFN-β的产生。5.敲除OTUD5后下调DNA信号通路下游细胞因子的表达取Otud5 fl/Y以及Otud5 fl/YLyz2-Cre老鼠的原代腹腔细胞,分别用ISD、HSV-60、cGAMP刺激,HSV-1感染细胞,实时定量PCR检测下游细胞因子mRNA水平变化。结果显示,在敲除OTUD5后,加ISD、HSV-60、cGAMP刺激,以及HSV-1感染所介导的Ifnb1mRNA水平明显下降,下游基因Ccl5和Cxcl10 mRNA水平也明显降低,进一步表明OTUD5正向调控DNA信号通路介导的IFN-β的产生。6.OTUD5促进DNA信号通路活化DNA信号通路活化后,能够促使TBK1分子和IRF3分子发生磷酸化,磷酸化的IRF3分子发生二聚化入核,促进IFN-β的产生。使用适龄的野生型小鼠,获得原代腹腔巨噬细胞,转染siRNA48h后,分别用ISD、HSV-60、cGAMP刺激,以及HSV-1感染细胞,Western Blot检测结果显示IRF3、TBK1磷酸化水平均有明显下降趋势。取Otud5 fl/Y以及Otud5 fl/Y Lyz2-Cre老鼠的原代腹腔细胞,分别用 ISD、HSV-60、cGAMP 刺激,Western Blotting 检测在敲除 OTUD5 后,TBK1、IRF3的磷酸化水平明显降低,非变性Western Blotting检测IRF3的二聚化水平,结果表明在敲除OTUD5后,IRF3二聚化水平明显降低。7.OTUD5在机体中具有抗DNA病毒能力取Otud5 fl/Y以及Otud5 fl/YLyz2-Cre老鼠,腹腔注射HSV-1病毒72h后取脑组织研磨取上清,通过qPCR技术检测,可以得出敲除OTUD5后DNA复制能力升高。通过小鼠致死实验检测生存率,可以看到在敲除OTUD5后小鼠的死亡速度更快,取脑组织通过免疫组化检测HSV-1病毒的复制情况,结果提示敲除OTUD5后HSV-1病毒复制能力增强。结论:1.OTUD5与STING相互作用,使STING发生K48位的去泛素化作用,能够稳定STING。2.OTUD5能够促进巨噬细胞的Ⅰ型干扰素产生,进而提高细胞或机体的抗DNA病毒的能力。