禽腺病毒4型（Fowl Adenovirus Serotype 4,FAdV-4）是一种无囊膜的ds DNA病毒。近年来,FAdV-4引起的禽心包积液性肝炎综合征（Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS）广泛流行给我国乃至全球养禽业造成了重大经济的损失,已成为严重危害全国家禽仅次于禽流感病毒的病原。Micro RNA在病毒和宿主相互作用过程中的发挥重要的调节作用,广泛参与病毒的感染过程并双向调控宿主天然免疫反应,然而,miRNA在FAdV-4感染所引起的宿主细胞反应中的作用与机理还不清楚,需要深入研究。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）-干扰素刺激因子（STING）信号通路是天然免疫系统的一个重要组成部分,在DNA病毒免疫应答中起着重要作用,其功能是检测胞质DNA的存在,并在反应中触发I型干扰素和炎症基因的表达。cGAS-STING信号通路与miRNA之间的相互作用是多向化的过程,cGAS-STING通路识别病毒感染会启动先天性免疫应答信号传导级联反应,致使miRNA表达变化。同时,miRNA也会调控基因表达变化,调节先天免疫反应,但miRNA如何在FAdV-4感染与cGAS-STING通路之间发挥调控作用的研究尚未见报道。为此,开展miRNA介导cGAS-STING通路调控FAdV-4感染的作用机制研究具有重要意义。本研究以FAdV-4感染LMH细胞为切入点,建立FAdV-4感染模型,通过高通量测序技术获取FAdV-4感染后的miRNAs表达谱,筛选参与FAdV-4感染LMH的差异表达miRNAs和干扰素信号通路,深入研究FAdV-4感染引起的免疫反应及相关调控机制,为阐明FAdV-4感染与宿主天然免疫之间的相互作用,明确FAdV-4感染的分子致病机制及筛选抗FAdV-4感染的新的治疗靶标提供新策略。主要研究内容及结果如下:1、FAdV-4细胞感染模型的建立及其miRNA表达谱和干扰素通路筛选为探究miRNA在FAdV-4感染过程中的生物学功能,从分子细胞水平揭示FAdV-4感染对宿主miRNA的动态变化及其对宿主天然免疫的影响。通过建立FAdV-4感染细胞模型,开展miRNA调控FAdV-4与宿主的互作研究。选取LMH细胞为研究对象,接种1MOI剂量FAdV-4 AH-F19株,于感染后0h、12h、24h、48h及72h,收集细胞样品进行sRNA测序分析。结果表明,所有样品共得到2,861个miRNA,其中已知miRNA 962个,新预测miRNA 1,899个。感染12 h时有176个差异表达基因;感染24 h时有174个差异表达基因;感染48 h时有383个差异表达基因;感染72 h时有688个差异表达基因。对差异的miRNAs进行靶基因预测,并将靶基因进行GO和KEGG分析,结果显示cGAS-STING信号通路、MAPK信号通路及m TOR信号通路等IFN相关通路参与了FAdV-4感染的过程。在感染后12h时,chSTING表达量上调,然而在24和48h时,其表达被显著抑制,同时IFN-β的表达也受到抑制。本研究获得了FAdV-4感染LMH细胞的miRNA表达谱,并筛选出chSTING开展后续研究,为FAdV-4感染及其与宿主互作机制提供数据基础。2、chSTING在FAdV-4感染诱导IFN-β产生和病毒复制中的作用FAdV-4感染显著影响chSTING的表达,为了探明chSTING在FAdV-4感染与宿主细胞病毒免疫反应中的作用,首先制备chSTING单克隆抗体,对抗体的类别和亚型进行鉴定。然后,利用慢病毒技术构建chSTING稳定过表达细胞株,并用CRISPR/Cas9技术构建chSTING缺失细胞株。然后利用FAdV-4分别感染LMH细胞野生株、过表达chSTING及chSTING缺失细胞株。最后,检测感染后IFN-β、IL-1β、IL-8及部分ISGs的表达水平以及FAdV-4拷贝数。结果表明,获得2株能稳定分泌抗chSTING抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C6、5B9。2种单抗的轻链类型皆为Kappa型,重链类型均为Ig G1。chSTING的过表达能够通过诱导IFN-β,IL-6和IL-8,提高抗病毒基因GPATCH-3和MX1的表达抑制FAdV-4的复制;反之,抑制IFN-β等细胞因子及GPATCH-3和MX1的表达促进FAdV-4的复制。因此,chSTING在FAdV-4感染期间对IFN-β和部分ISGs的表达发挥正调控作用。本研究进一步明确了cGAS-STING信号通路在FAdV-4感染LMH细胞诱导IFN-β的过程中起着关键作用。探明了chSTING在FAdV-4致病机制中的作用及对FAdV-4的防控提供了新的思路。3、鸡miRNA-181a-5p靶向chSTING调控FAdV-4感染的作用研究miRNAs在病毒和宿主互作中的发挥重要的调节作用。前期研究结果发现在FAdV-4感染后期,chSTING的表达被显著抑制,但miRNA如何调控chSTING尚不清楚。基于本研究已有结果,探讨miRNA在FAdV-4感染过程中对chSTING的调控作用,首先通过miRbase预测调控chSTING 3’UTR的miRNA;然后,运用双荧光素酶报告基因系统检测,Western Blot和IFA技术明确与chSTING特异性结合的miRNA及其对chSTING表达的影响;最后,探明目标miRNA对FAdV-4复制及chSTING介导的信号通路的影响。结果表明,通过生物信息学分析筛选出gga-miR-181a-5p和gga-miR-12286-5p,但gga-miR-181a-5p能调控chSTING 3’UTR的活性,在m RNA和蛋白质水平上负调控chSTING表达。过表达gga-miR-181a-5p会抑制FAdV-4在LMH细胞中的复制,反之,促进病毒复制;gga-miR-181a-5p能够抑制chSTING介导的信号传导途径,负调控NF-κB,IRF7和IFN-β信号传导及部分抗病毒基因表达。本研究证明gga-miR-181a-5p作为负反馈调节剂参与抗病毒免疫反应的研究,为探索FAdV-4与宿主天然免疫之间的相互作用及潜在的抗病毒靶标提供了基础依据。综上所述,本研究通过分析FAdV-4感染LMH细胞的miRNA表达谱,筛选出感染激活的IFN通路,并进一步发现在FAdV-4感染前期,chSTING表达量显著上调,在感染后期,其表达被显著抑制。为探明chSTING在FAdV-4感染诱导IFN-β产生和病毒复制中的作用,在转录水平和蛋白水平明确了chSTING在FAdV-4感染期间正调控IFN-β和部分ISGs的表达。首次发现了gga-miR-181a-5p能够抑制chSTING介导的信号传导途径,FAdV-4能够通过gga-miR-181a-5p/chSTING信号轴来调控宿主天然免疫实现FAdV-4介导的免疫逃避,丰富了FAdV-4感染和致病机制理论基础,为深入探究FAdV-4致病机制奠定了基础。