目的:初步“绘制”四妙君逸软膏止痛兼促愈、抗炎作用机制的网络“图谱”,以寻找有别于化学药物作用特点的中药复方新药。方法:基于神经-内分泌-免疫网络系统(neuroendocrine-immunoregulatory network,即NEI网络系统)理论,从疼痛、创面愈合和炎症反应三个方面设计实验,结合前期研究结果优选出与之相关性最高的多个分子靶点以及多条机制进行研究。1.实验一:建立醋酸致痛小鼠模型。分为空白对照组、盐酸纳洛酮组、四妙君逸软膏组、四妙君逸软膏+盐酸纳洛酮组,观察各组小鼠15分钟内扭体次数。2.实验二:建立醋酸致痛小鼠模型。采用酶联免疫吸附法(ELISA法),检测各组小鼠外周血清中镇痛物质β-EP和致痛物质PGE2的表达;采用ELISA法检测各组小鼠中枢脑组织匀浆液中神经递质5-HT和GABA的含量;采用石蜡切片免疫组化染色法,检测中枢下丘脑中5-HT2A受体和大脑皮层中GABAA受体的表达水平。3.实验三:建立大鼠全层皮肤切除创伤模型。将SD大鼠分为模型组(M组)、空白基质组(K组)、重组人表皮生长因子凝胶组(CZ组)、龙珠软膏组(LZ组)、四妙君逸软膏组(SM组)。每大组内再随机平分为3小组,其中1个小组大鼠从宏观整体水平观察造模后第7天和14天背部创面一般愈合情况、愈合面积、愈合率和最终愈合时间;剩余的2个小组大鼠分别于造模后第7和第14天两个时间点处死,采集标本,从微观水平观察大鼠背部创面病理组织愈合情况、创面蛋白浓度、EGFR、TGF-α和IL-1β表达水平。4.实验四:建立肛肠病术后大鼠模型。观察各组大鼠一般整体情况以及肛门局部情况、肛门创面病理组织愈合情况;用ELISA法检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-10浓度。结果:1.实验一:四妙君逸软膏组扭体次数最少,四妙君逸软膏+纳洛酮组次之,两组间比较有统计学意义(P<0.05)。2.实验二:(1)β-EP浓度值:3个用药组与模型组相比,表达水平均有所降低,其中专利方四妙君逸软膏组最低,有高度统计学意义(p<0.01)。(2)pge2浓度值:3个用药组与模型组均有所下降,其中四妙君逸软膏组下降最多,有高度统计学意义(p<0.01)。(3)脑中gaba的浓度值:3个用药组与模型组相比,其表达水平均升高,且差异显著(p<0.01),但3个用药组间比较无统计学意义(p>0.05)。(4)脑中5-ht的浓度值:3个用药组与模型组相比,其表达水平均升高,且差异显著(p<0.01),但是3个用药组组间无统计学意义(p>0.05)。(5)下丘脑5-ht2ar灰度值:3个用药组较模型组灰度值明显降低,有高度统计学意义(p<0.01),3组间比较无统计学意义(p>0.05)(6)大脑皮层gabaar灰度值:3个用药组较模型组灰度值明显降低,有高度统计学意义(p<0.01),但是3个用药组间比较无统计学意义(p>0.05)。3.实验三:1)宏观整体水平(1)第7天和第14天,sm组愈合率均高于m组,有高度统计学意义(p<0.01)。(2)sm组右侧创面最终愈合时间比m组短,有高度统计学意义(p<0.01)。2)微观水平:(1)不同时相点各组大鼠创面组织病理学评分比较:第7天得分,cz组>sm组>lz组>k组>m组,其中sm组与m组比有高度统计学意义(p<0.01),与cz组比有统计学意义(p<0.05),与lz组比较有统计学意义(p<0.05)。第14天,cz组>sm组>lz组>k组>m组,其中sm组与m组比有高度统计学意义(p<0.01),与cz组比有统计学意义(p<0.05),但与lz组比无统计学意义(p>0.05)。(2)不同时相点各组大鼠创面蛋白浓度比较:第7和第14天各组大鼠蛋白浓度趋势均相同,即sm组>lz组>cz组>k组>m组。第7天,sm组与cz组比较高度统计学意义(p<0.01),与lz组比较无统计学意义(p>0.05)。第14天,sm组与cz组比较有高度统计学意义(p<0.01),与lz组比较有高度统计学意义(p<0.01)。(3)不同时相点各组大鼠egfr免疫组化的灰度值:第7天,cz组<sm组<lz组<k组<m组,其中sm组与m组比较有高度统计学意义(p<0.01),与cz组比较有高度统计学意义(p<0.01),与lz组比无统计学意义(p>0.05)。第14天,cz组<sm组<lz组<m组<k组,sm组与m组相比有高度统计学意义(p<0.01),与cz组比较有高度统计学意义(p<0.01),与lz组比无统计学意义(p>0.05)。(4)不同时相点各组大鼠血清中tgf-α表达水平:第7天,sm组>lz组>cz组>k组>m组,sm组与m组比有高度统计学意义(p<0.01),与cz组比有高度统计学意义(p<0.01);sm组与lz组比有统计学意义(p<0.05)。第14天,sm组>lz组>cz组>k组>m组,sm组与m组比有高度统计学意义(p<0.01),与cz组比有统计学意义(p<0.05),与lz组比无统计学意义(p>0.05)。(5)不同时相点各组大鼠血清中il-1β含量比较:第7天,sm组<lz组<cz组<k组<m组,sm组与m组比有高度统计学意义(p<0.01),但sm组、lz组和cz组间无统计学意义(p>0.05)。第14天,血清中il-1β含量极微,elisa检测显色不明显,未检测到。4.实验四(1)il-10:盐酸丁卡因胶浆组>四妙君逸软膏组>正常组>卡波姆基质组>模型组,四妙君逸软膏与盐酸丁卡因胶浆组比较有统计学意义(p<0.05),与模型组比有高度统计学意义(p<0.01)。(2)il-6:正常组<四妙君逸软膏组<盐酸丁卡因胶浆组<卡波姆基质组<模型组,四妙君逸软膏组与盐酸丁卡因胶浆组比较有统计学意义(p<0.05),与模型组比有高度统计学意义(p<0.01)。(3)tnf-α:正常组<四妙君逸软膏组<盐酸丁卡因胶浆组<卡波姆基质组<模型组,四妙君逸软膏组与盐酸丁卡因胶浆组比较无统计学意义(p>0.05),与模型组比有高度统计学意义(p<0.01)。结论:1.四妙君逸软膏主要通过对外周血清中镇痛物质β-ep和致痛物质pge2的调节发挥外周镇痛作用,其次可能通过对中枢神经递质5-ht及其受体5-ht2a,gaba及其受体gabaa表达的调节发挥部分中枢镇痛作用。2.四妙君逸软膏可能通过提高tgf-α和egfr的表达水平,促进两者结合,进而促进血管新生和修复,帮助肉芽组织新生,达到创面愈合。其次,它能够降低血清中il-1β浓度,控制局部炎症,从而给免疫细胞创造一个“好”的微环境,促进相关生长因子和细胞因子的释放,从而促进创面愈合。3.四妙君逸软膏可能通过调节致炎细胞因子il-6、tnf-α和抗炎细胞因子IL-10的平衡,改善微环境,起到抗炎的作用。综上,基于NEI网络系统理论,四妙君逸软膏可能通过调节机体多个分子靶点:镇痛-致痛物质、抗炎-促炎细胞因子、生长因子-受体、神经递质-受体之间的平衡产生止痛、促愈和抗炎的作用。