玛咖是十字花科独行菜属草本植物,被盛誉为“秘鲁人参”,目前我国云南,新疆,西藏等地区引种成功,市场玛咖产品种类繁多,由于其产地及品种的不同,且产品多围绕其壮阳功效予以夸大宣传,导致市场混乱,鱼龙混杂,长远来看,将会极大影响玛咖产业的健康发展。早期主要研究集中其初生代谢产物。近年来发现玛咖越来越多的其它生理作用,对其次生代谢产物如玛咖酰胺、玛咖烯、芥子油苷等及其药理作用研究逐渐增多。本论文系统阐述了玛咖的化学成分并对其体内外神经保护作用及其作用机制进行了初步探讨。一.玛咖化学成分分离本研究首先对玛咖成分进行了基本系统分离,分离鉴定了 23个化合物,包括12个生物碱类(7个玛咖酰胺类生物碱,2个吡啶类生物碱,1个咔啉类生物碱,2个普通酰胺类生物碱),3个芥子油苷类,4个有机酸类,4个其他类化合物,所分离鉴定的23个化合物中6个在本植物中为首次发现。二.玛咖化学成分分析建立了用以分析玛咖中次生代谢产物的UHPLC-ESI-Orbitrap MS分析方法,总结了玛咖酰胺,吡啶类、咔啉类、咪唑类生物碱、芥子油苷、玛咖烯的多级质谱裂解规律(吡啶类和咔啉类生物碱的裂解规律是首次推导),并运用上述裂解规律鉴定了玛咖中的159个化合物。为使峰增加且不同类有效成分富集,玛咖甲醇提取物通过ODS柱分为6个组分(Fr1-Fr6)进行鉴定和推导,包括64个玛咖酰胺类、3个吡啶类、38个咪唑类、16个咔啉类生物碱、14个芥子油苷类、11个玛咖烯类、5个有机酸类和8个其他类化合物。建立了利用液相串联三重四级杆质谱(UHPLC-ESI-QqQ MS)定量分析玛咖中的活性成分,运用动态多反应离子监测(DMRM)技术定量17个不同产地,不同类型和不同部位的玛咖中14个代表性化合物(甲氧基苄基芥子油苷、苄基芥子油苷、对羟基苄基芥子油苷、N-(3-甲氧基苄基)-十六碳酰胺、N-苄基苯甲酰胺、N-苄基十六碳酰胺、甘草查尔酮、1,2-二氢-4-甲醛-3-苯甲基-N-羟基吡啶、4-甲醛-3-甲氧基苄基-N-吡啶、N-乙酰苄胺、苯乙酰胺、烟酸、琥珀酸、(1R,3S)-1-甲基-β-咔啉-3-甲醛。芥子油苷类(10.97～79.84 mg/g)和生物碱类(0.54～2.99 mg/g)是玛咖中的主要成分,并分析比较了国内引种和国外秘鲁原产地,国内产地之间,不同品种及不同部位的差异,表明原产地和国内引种产地的玛咖有效成分含量是有差别的,芥子油苷类和咔啉类生物碱在秘鲁玛咖样品中的含量高于在中国种植的玛咖。然而,在中国种植的玛咖中有机酸类,吡啶类生物碱,普通酰胺类生物碱和玛咖酰胺的含量是高于在秘鲁原产地种植的。结果表明云南种植的玛咖为成为秘鲁原产地可能的替代品提供了依据,国内不同产地之间云南产的玛咖次生代谢产物的含量较西藏和新疆地区的多;对于不同品种的玛咖,经过我们的实验发现黄玛咖和紫玛咖的次生代谢产物含量类似,远不及市场上宣传的那样质量有显著性差异,对于过度宣传的质量差异有待进一步研究;对于植株不同部位的玛咖,玛咖根中的有效成分是显著高于叶中的,这可能与玛咖的生物合成途径有关,且叶中也有一定含量的芥子油苷类和玛咖酰胺类生物碱,为扩大玛咖资源利用奠定了基础。三.玛咖神经保护作用研究本实验采用MPTP诱导斑马鱼神经损伤模型研究不同组分及单体的神经保护作用,总提取物显示有神经保护作用,Fr4(普通酰胺生物碱,吡啶生物碱),Fr5(咪唑生物碱,玛卡酰胺,玛咖烯),Fr6(玛咖酰胺)有不同程度的神经保护作用且具有剂量依赖性,尤其是80%乙醇洗脱部位。结合玛咖化学成分分析,Fr5和Fr6部位都含有高含量的N-苄基十六碳酰胺(A54)。N-苄基十六碳酰胺且作为单体化合物显示有显著地神经保护作用且有剂量依赖性。采用乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制实验进行了体外验证,这些发现表明玛咖是通过多巴胺能系统和胆碱能系统之间的协同作用显示神经保护作用的。玛咖神经保护作用的机制之一可能是提高脑内乙酰胆碱和丁酰胆碱的水平,N-苄基十六碳酰胺作为单体体内体外均验证了具有神经保护作用,说明玛咖酰胺类化合物确实是玛咖起神经保护作用的主要化合物类型。为了探讨N-苄基十六碳酰胺作用于MPTP诱导的MN9D细胞的保护作用,本研究采用MPP+损伤MN9D细胞建立神经损伤体外模型,研究N-苄基十六碳酰胺的保护作用,筛选MPP+作用于MN9D细胞的合适造模浓度为500μM,起到神经保护作用的N-苄基十六碳酰胺的合适浓度范围为50-100 μM。500μM MPP+作用MN9D细胞24 h,细胞的存活率降低至约50%,从细胞显微镜下也可以看到细胞形态的变化,对照组MN9D细胞大部分贴壁,大部分细胞有突起生长,且逐步向外延伸,模型组500μMMPP+作用MN9D细胞24h后,细胞贴壁数目较少,突起消失,因此选择此浓度作为本研究的造模浓度;N-苄基十六碳酰胺浓度为100 μM时可显著减轻MPP+造成的MN9D神经元细胞损伤,倒置显微镜下观察与模型组比较,N-苄基十六碳酰胺给药组显示贴壁数目增多,大部分细胞有突起生长恢复,且逐步向外延伸。说明N-苄基十六碳酰胺对MPTP诱导的MN9D小鼠多巴胺能神经元损伤细胞具有保护作用。利用UHPLC-ESI-QqQ MS测定N-苄基十六碳酰胺作用于MPP+诱导的MN9D细胞损伤前后神经递质的含量变化,分别绝对定量和相对定量了细胞上清液和细胞中的12种和17种神经递质,造模后下降,给予N-苄基十六碳酰胺48h后又回升的神经递质细胞上清液中主要有谷氨酸,牛磺酸,去甲肾上腺素,胆碱,乙酰胆碱,丁酰胆碱且这些氨基酸类、单胺类和胆碱类神经递质呈剂量依赖性关系。细胞中主要有谷氨酸,去甲肾上腺素,丁酰胆碱,天冬氨酸,高香草酸也呈剂量依赖性关系。而对于细胞上清液中的5-羟色胺及细胞中的5-羟色胺和精氨酸呈现模型后上升给药后又下降的趋势,而N-苄基十六碳酰胺对其余的神经递质调节作用则不明显。由此可知细胞上清液和细胞中谷氨酸,去甲肾上腺素和丁酰胆碱在N-苄基十六碳酰胺给药后同时都具有显著性差异且具有剂量依赖性,尤其是胆碱类神经递质,推测机制N-苄基十六碳酰胺能升高乙酰胆碱和丁酰胆碱的水平与第二部分内容结果相呼应,有可能通过胆碱能系统来调节多巴胺能系统,从而起到神经保护作用。运用LTQ-Orbitrap MS分析了 N-苄基十六碳酰胺干预MPP+损伤MN9D细胞中的差异表达蛋白。结果显示给模型药后降低给药后升高且呈剂量依赖性关系的差异蛋白有142个,给模型药后升高给药后降低且呈剂量依赖性关系的差异蛋白有209个,且在Mev.4.9.0软件分析后ANOVA统计检验P小于0.01后,4组共有的差异蛋白60个,使用uniprot数据库对其进行功能注释且根据丰度高的筛选出34个差异蛋白,参与细胞过程的蛋白所占比例较大,KEGG数据库显示其参与细胞自噬,NF-κB信号通路,Toll样受体信号通路,MAPK信号通路,EGFR酪氨酸酶抑制剂抗性,p53信号通路,细胞程序性凋亡等信号通路,说明N-苄基十六碳酰胺的神经保护作用靶点通路与细胞过程炎症相关。基于UPLC-Q-TOF系统建立了 N-苄基十六碳酰胺对MPP+神经损伤的MN9D细胞的脂质代谢组学研究方法,将所得数据导入SIMCA-P13.0软件进行正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA),根据每组数据的RSD值需大于30%,同时从中挑选出VIP>1.5的代谢物离子,并经过t检验,P<0.05认为差异有统计学意义,筛选出与MPP+神经损伤相关且N-苄基十六碳酰胺药物治疗后的差异脂质代谢物。正常组找出111个差异性脂质分子,模型组组找出114个差异性脂质分子,给药组找出115个差异性脂质分子,3组共有的差异性脂质分子有108个,结果显示,MPP+神经损伤可能与甘油磷脂酰胆碱(PC),磷脂酰乙醇胺(PE),鞘磷脂(SM),磷脂酸(PA),甘油三酯类(TG)代谢密切相关。综上所述,玛咖次生代谢产物主要有玛咖酰胺,吡啶类生物碱,咔啉类生物碱,咪唑类生物碱,芥子油苷和玛咖烯等。其中玛咖酰胺是玛咖起神经保护作用的主要化合物类型,一方面可能通过提高脑内谷氨酸、乙酰胆碱、丁酰胆碱、去甲肾上腺素等神经递质的水平,另一方面通过调节某些差异脂质分子和蛋白质发挥此作用,具有明显生物学意义的差异蛋白质和脂质分子仍需进一步进行相关验证,找出N-苄基十六碳酰胺起神经保护作用的代谢通路和靶点。