第一部分芹菜素对膀胱癌T24细胞的抑制作用及其机制的研究背景在我国,膀胱癌是泌尿系肿瘤发病率最高的恶性肿瘤。近年来,膀胱癌的发病率还在呈现一种上升的趋势。膀胱癌的主要治疗手段是手术和化疗等。芹菜素是一种天然的黄酮类化合物,广泛存在于我们日常能接触到的水果和蔬菜中。芹菜素被证明在多种肿瘤中具有抑癌作用,但其对膀胱癌的作用尚未得到验证。目的本研究通过体外实验探索芹菜素对膀胱癌T24细胞系的影响和相应的作用机制,并通过体内的裸鼠成瘤实验进一步验证细胞实验的结果。方法芹菜素以不同浓度(10-80μ,M)和不同时间(24-72h)作用于T24细胞,采用MTT法检测T24细胞在增殖和活性方面的改变,采用流式细胞术检测细胞在周期和凋亡方面的改变,采用Transwell实验检测细胞在运动能力方面的改变,采用Western Blot实验检测相应蛋白的改变。采用BSP克隆测序法检测PTEN的甲基化水平。构建裸鼠成瘤模型检测芹菜素在体内实验中对肿瘤的影响。结果1.芹菜素以一种时间-剂量依赖的方式抑制膀胱癌T24细胞的增殖,表现为随着浓度的升高、作用时间的延长,对细胞的抑制作用越强。2.芹菜素作用浓度为10和20gM时,T24细胞的增殖未被明显抑制,当浓度增加到40和80μM时,增殖被明显抑制。作用时间为24h,48h和72h的IC50浓度分别为82.5,52.9和43.8μM。3.芹菜素以10和20μM的浓度作用于T24细胞24小时后,经Transwell实验检测,细胞的迁移和侵袭能力都明显减弱。4.芹菜素以20,40和80μM的浓度作用于T24细胞24小时后,经流式细胞仪(PI和annexin V双染法)检测,细胞出现了明显的凋亡,以晚期凋亡的增加为主,并随着浓度的提高,凋亡比例相应提高。5.芹菜素以20,40,80,120和160μM的浓度作用于T24细胞24小时后,经流式细胞术检测,细胞出现了显著的G2/M期阻滞,并随着浓度的升高,G2/M期阻(?)愈加明显。6.芹菜素以20,40和80μM的浓度作用于T24细胞24小时后,随着浓度增加,细胞pro caspase-3的表达逐渐下降,active caspase-3的表达逐渐上升,PARP裂解片段的表达逐渐上升,细胞中p-Akts PDK和PI3K的表达逐渐下降,同时细胞内促凋亡蛋白Bax、Bad的表达逐渐升高,抗凋亡蛋白Bcl-x1、Bcl-2的表达逐渐下降,而Akt的表达没有明显变化。7.芹菜素与PI3K抑制剂LY294002同时作用后,与芹菜素单独作用相比,芹菜素导致的p-Akt的下降,PARP裂解片段的增加,active caspase-3的上调都不同程度得到了削弱。8.芹菜素以20,40和80μM的浓度作用于T24细胞后,PTEN蛋白的表达逐渐上升,并且在T24, UM-UC-3和5637细胞中,芹菜素都下调了PTEN的甲基化水平。9.在裸鼠膀胱癌成瘤实验中,随着局部注射芹菜素浓度的增加,裸鼠背部形成的肿瘤体积逐渐缩小。结论芹菜素以浓度-时间依赖的方式抑制T24细胞的增殖能力,并诱导其凋亡和G2/M期周期阻滞,抑制T24细胞的迁移侵袭能力。芹菜素抑制T24细胞PI3K/PDK/Akt通路的激活,调节Bcl-2蛋白家族进而诱导凋亡。第二部分芹菜素增强顺铂对膀胱癌T24细胞的抑制作用及机制的研究背景联合化疗(MVAC方案或GC方案等)是治疗转移性膀胱癌的一线方案,铂是最有效的膀胱癌全身化疗药物,然而以顺铂为基础的一线化疗方案增加的中位生存时间仅为7-9个月。对顺铂产生药物抵抗是膀胱癌化疗的一个重大障碍,核苷酸切除修复(NER)是顺铂耐药重要机制之一,而ERCC-1是NER途径的重要因素。目的本研究通过体外实验研究芹菜素与顺铂联合使用对膀胱癌T24细胞的作用及其机制。方法顺铂以不同浓度(5-30μM)作用于T24细胞24小时,采用MTT法检测细胞增殖和活性的改变。选取顺铂和芹菜素单独或共同作用于T24细胞,采用MTT法和克隆形成实验检测细胞增殖和活性的改变,采用Trasnwell实验检测细胞侵袭能力的改变,采用RT-PCR实验检测ERCC-1 mRNA的表达,采用Western Blot实验检测相应蛋白的改变。结果1.顺铂以浓度依赖的方式抑制膀胱癌T24细胞的增殖,浓度越高,抑制作用越明显。顺铂作用于T24细胞24小时的IC50约为14.8μM。2.顺铂(15μM)和芹菜素(40μM)单独或共同作用于T24细胞24小时,MTT实验表明芹菜素增强了顺铂对T24细胞增殖的抑制作用,克隆形成实验表明芹菜素增强了顺铂对T24细胞克隆形成能力的抑制作用。3.顺铂(10μM)和芹菜素(20μM)单独或共同作用于T24细胞24小时,Transwell实验表明芹菜素增强了顺铂对T24细胞侵袭能力的抑制作用。4.顺铂(15μM)和芹菜素(40μM)单独或共同作用于T24细胞24小时,RT-PCR实验表明顺铂上调了T24细胞ERRC-1 mRNA和蛋白的表达,而芹菜素明显抑制了顺铂对ERRC-1 mRNA和蛋白的上调作用。结论顺铂以浓度依赖的方式抑制膀胱癌T24细胞的增殖能力。芹菜素能明显增强顺铂对T24细胞的抑制作用,并且芹菜素能明显下调顺铂导致的T24细胞中ERCC-1的上调效果。第三部分芹菜素对前列腺癌DU145细胞运动能力的影响及其机制的研究背景在欧美国家,前列腺癌是男性中发病率最高的恶性肿瘤,并且是导致死亡的肿瘤的第二位。在我国,前列腺癌的发病率也在逐年上升。相比欧美国家,亚洲男性较低的前列腺癌发病率与饮食因素有一定的联系。有研究表明芹菜素对前列腺癌有一定的抑制作用,但能否抑制前列腺癌的转移尚未可知。目的本研究通过体外实验验证芹菜素对前列腺癌DU145细胞运动能力的影响及其机制。方法芹菜素以不同浓度(10-80μM)和不同时间(24-48h)作用于DU145细胞,采用MTT法检测细胞增殖和活性的改变,采用流式细胞仪检测细胞周期的改变,采用划痕实验和Transwell实验检测细胞运动能力的改变,采用RT-PCR检测MMPs mRNA的改变,采用Western Blot实验检测相应蛋白的改变。结果1.芹菜素以一种时间-剂量依赖的方式抑制前列腺癌DU145细胞的增殖,表现为浓度越高、作用时间越长,对细胞的抑制作用越强。2.芹菜素的作用浓度为40和80μ,M时,对DU145细胞的IC50值在24和48小时分别为80.8和49.3μM。3.芹菜素以10和20μM的浓度作用于DU145细胞24小时后,划痕试验表明细胞的迁移能力得到了抑制,Transwell实验表明细胞的运动能力得到了抑制。4.芹菜素以20,40和80μM的浓度作用于DU145细胞24小时后,经流式细胞仪检测,细胞出现了G2/M期阻滞。随着浓度的增加,G2/M期的比例逐渐升高。5.芹菜素5,10和20μM的浓度作用于DU145细胞24小时后,随着浓度的增加,细胞中E-cadherin蛋白的表达逐渐升高,Snail和Vimentin蛋白的表达逐渐下降,MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达都逐渐下降。结论芹菜素以浓度-时间依赖的方式抑制DU145细胞的增殖能力,并诱导G2/M期周期阻滞,抑制DU145细胞的迁移侵袭能力。芹菜素通过抑制DU145细胞上皮间质转化(EMT)的过程和MMPs来抑制细胞的运动能力。