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精子发生是一个高度复杂而有序的多基因调控的细胞分化过程。已证实很多基因如Fank1,Spem1、RIM-BP3,DAZAP1、TSPY1等都参与精子发生,研究这些基因的功能及表达调控通路对认识精子发生的机制有重要的意义。
Fank1是睾丸组织特异表达的一种核蛋白,从精子发生过程的减数分裂到单倍体阶段持续表达,通过调控下游基因的表达发挥重要的作用。睾丸组织Fank1蛋白能够激活转录因子AP1的转录活性,从而影响下游靶基因的表达。转录因子AP1包括四个家族,分别是c-Jun、c-Fos、ATF和JDP家族,在四个家族成员中,c-Jun具有很强的转录活性,在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥作用。载脂蛋白C2(ApoC2)是载脂蛋白C家族中最重要的亚类之一,它可以通过激活下游的脂蛋白脂肪酶(LPL)参与脂类转运及代谢,在哺乳动物生殖过程中发挥重要的作用。
本实验室前期工作中,通过基因芯片技术分析Fank1基因敲减小鼠睾丸组织的基因表达谱,发现Fank1表达下降的同时,AP1(c-Jun)、ApoC2、LPL表达下调,提示睾丸组织中AP1(c-Jun)、ApoC2和LPL的表达受到Fank1表达水平的影响,这些基因组成的调控通路可能在精子发生过程中发挥重要作用。目前对小鼠ApoC2启动子的转录活性及Fank1与ApoC2的调控关系还未见报道,因此本研究拟采用RT-PCR以及细胞转染和双荧光素酶报告基因实验等方法对Fank1基因敲减小鼠睾丸组织中ApoC2表达下调的机制进行研究。
材料与方法：
一、实验材料
1、pGL3-Basic、pRL-TK、pcDNA3.0载体;
2、人胚肾293T细胞;
3、细胞培养及细胞转染相关试剂;
4、分子克隆及PCR相关试剂;
5、SPF级C57BL/6J小鼠;
6、双荧光素酶检测试剂盒。
二、实验方法
(一)RT-PCR验证Fank1基因敲减小鼠睾丸组织基因芯片结果
提取Fank1基因敲减小鼠睾丸组织总RNA,利用RT-PCR方法对基因芯片结果进行验证。
(二)ApDC2启动子及转录因子结合位点的预测
1、用启动子预测软件http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html分析C57BL/6J小鼠ApoC2(Gene Bank Gene ID:11813)-2000bp～+700bp区域,预测启动子序列。
2、用转录因子预测网站http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess对ApoC2启动子-1959bp～+470bp区域进行分析,预测此区域转录因子结合位点。
(三)小鼠ApoC2启动子不同区域荧光素酶表达质粒的构建
1、根据启动子预测结果设计7对PCR引物,以C57BL/6J小鼠基因组DNA为模板,扩增7段启动子区域不同长度的DNA片段,将片段克隆至pGL3-Basic载体中,构建ApoC2启动子不同区域荧光素酶表达质粒。
(四)pcDNA3.0-Fank1及pcDNA3.0-c-Jun真核表达质粒的构建
利用RT-PCR的方法从C57BL/6J小鼠睾丸组织中扩增Fank1及c-Jun基因cDNA全长序列,构建pcDNA3.0-Fank1及pcDNA3.0-c-Jun真核表达质粒。
(五)细胞转染实验
1、细胞水平验证Fank1对c-Jun、ApoC2表达的影响
将pcDNA3.0-Fank1表达质粒转染293T细胞,利用RT-PCR的方法检测Fank1、c-Jun、ApoC2在293T细胞中的表达。
2、细胞水平验证c-Jun对ApoC2表达的影响
将pcDNA3.0-c-Jun表达质粒转染293T细胞,利用RT-PCR的方法检测ApoC2在293T细胞中的表达。
3、ApoC2启动子不同区域转录活性分析
将含ApoC2不同启动子DNA片段的荧光素酶表达质粒pGL3-ApoC2-X分别和海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK共转染293T细胞,进行ApoC2启动子转录活性分析。
4、转录因子Fank1对ApoC2启动子转录活性的影响
将pcDNA3.0-Fank1表达质粒分别与ApoC2启动子荧光素酶表达质粒pGL3-ApoC2-X和海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK共转染293T细胞,进行启动子转录活性分析。
5、转录因子AP1(c-Jun)对ApoC2启动子转录活性的影响
将pcDNA3.0-c-Jun表达质粒分别与含ApoC2启动子荧光素酶表达质粒pGL3-ApoC2-X和海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK共转染293T细胞,进行启动子转录活性检测。
结果：
一、RT-PCR结果显示,Fank1基因敲减小鼠睾丸组织中c-Jun基因表达下调,ApoC2基因表达下调,LPL基因表达下调。
二、启动子预测结果显示,ApoC2启动子位于-1959bp～+470bp区域;转录因子结合位点分析结果显示,ApoC2启动子-1959bp～+470bp区域有AP1转录因子结合位点。
三、酶切及测序显示,ApoC2启动子不同区域荧光素酶表达质粒构建成功。
四、酶切及测序显示,pcDNA3.0-Fank1及pcDNA3.0-C-Jun表达质粒构建成功。
五、细胞转染实验
1、pcDNA3.0-Fank1表达质粒转染293T细胞,RT-PCR结果显示c-Jun、ApoC2表达增加。
2、pcDNA3.0-c-Jun表达质粒转染293T细胞,RT-PCR结果显示c-Jun、ApoC2表达增加。
3、ApoC2启动子转录活性分析显示,pGL3-ApoC2-F活性最强,pGL3-ApoC2-E、pGL3-ApoC2-G、pGL3-ApoC2-C次之,pGL3-ApoC2-A、pGL3-ApoC2-B和pGL3-ApoC2-D活性很弱。
4、双荧光素酶报告基因实验结果显示,Fank1对ApoC2启动子-1959bp～+470bp区域无明显作用。
5、双荧光素酶报告基因实验结果显示,c-Jun对ApoC2启动子-1959bp～+470bp区域有正调控作用。
结论：
1、Fank1基因敲减小鼠睾丸组织中AP1(c-Jun)、ApoC2基因表达下调。
2、ApoC2启动子-1959bp～+470bp区域存在正负调控区交替排列的现象,不同功能区域转录因子结合位点的存在很大差异。
3、转录因子AP1(c-Jun)通过作用于ApoC2启动子区域调控其转录活性,小鼠睾丸组织中Fank1蛋白通过此途径影响ApoC2的表达。