论文部分内容阅读
研究目的:1.观察与评价四神煎治疗膝骨关节炎（KOA）的临床疗效,为临床治疗KOA提供参考。2.观察KOA病理进程中巨噬细胞极化与巨噬细胞焦亡的内在联系。3.基于滑膜巨噬细胞极化和巨噬细胞焦亡,探索四神煎治疗KOA的疗效机制,为中医药防治KOA提供科学依据。研究方法:1.临床研究,将患者随机分为四神煎组、依托考昔组。服药4周,随访8周。于服药前、用药后第4周、第8周采集WOMAC评分评估膝关节症状情况,采集血液,通过ELISA检测各组血清中全身炎症因子:IL-6、IL-18、IL-1β,滑膜纤维化指标:TIMP1、VEGF、TGF-β,软骨退化指标:MMP-1、MMP-13的表达情况。2.实验研究,通过DMM建立大鼠KOA模型,将大鼠分为假手术组和KOA组,造模完成后取材,软骨番红固绿染色并对软骨作OARSI评分,滑膜组织行HE染色并作Krenn评分,滑膜组织免疫荧光双染色观察巨噬细胞极化情况,蛋白免疫印迹法（WB）检测滑膜组织中焦亡指标NLRP3、ASC、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平,WB检测滑膜纤维化指标TIMP1、VEGF、TGF-β蛋白水平,ELISA法检测血清中疼痛指标SP、CGRP蛋白表达水平。3.实验研究,通过DMM建立大鼠KOA模型,将大鼠分为假手术组、KOA组、低浓度中药组、中浓度中药组、高浓度中药组,用药完成后取材,WB检测滑膜纤维化指标TIMP1、VEGF、TGF-β蛋白水平,WB检测滑膜组织中细胞焦亡相关指标NLRP3、ASC、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平,ELISA法检测血清中疼痛指标SP、CGRP蛋白表达水平。4.实验研究,将大鼠分为假手术组、KOA组、抑制剂组、四神煎组,通过DMM建立大鼠KOA模型,NS8593抑制滑膜巨噬细胞极化,用药结束后取材,软骨番红固绿染色并对软骨破坏作OARSI评分,滑膜组织HE染色作Krenn评分,免疫荧光染色观察巨噬细胞极化情况,WB检测焦亡指标NLRP3、ASC、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平,WB检测滑膜纤维化指标TIMP1、VEGF、TGF-β蛋白水平,ELISA法检测血清中疼痛指标SP、CGRP蛋白表达水平,检测大鼠下肢机械痛敏情况。研究结果:1.在服药后第4周,四神煎组和依托考昔组炎性指标:IL-6、IL-18、IL-1β,滑膜纤维化指标:TIMPI、VEGF、TGF-β,软骨退化指标:MMP-1、MMP-13表达水平及WOMAC评分均明显低于用药之前（P＜0.05）,四神煎组各项炎症指标低于依托考昔组,但差异无统计学意义（P＞0.05）,四神煎组WOMAC评分和依托考昔组无明显差异（P＞0.05）。四神煎组治疗KOA的总有效率为92.5%,依托考昔组治疗KOA的总有效率为82.5%,四神煎组治疗KOA总有效率明显优于依托考昔组（P＜0.05）。在第8周,四神煎组炎性指标:IL-6、IL-18、IL-1β,滑膜纤维化指标:TIMP1、VEGF、TGF-β,软骨退化指标:MMP-1、MMP-13表达水平及WOMAC评分均明显低于用药之前（P＜0.05）,与第4周相比无明显差异（P＞0.05）。依托考昔组炎性指标:IL-6、IL-18、IL-1β,滑膜纤维化指标:TIMP1、VEGF、TGF-β,软骨退化指标:MMP-1、MMP-13表达水平明显低于用药之前（P＜0.05）,与本组第4周相比无明显差异（p＞0.05）。依托考昔组WOMAC评分与用药前相比较低,但明显高于四神煎组第8周随访结果（P＜0.05）,与本组第4周相比较低,但差异无统计学意义（P＞0.05）。2.与假手术组相比,KOA组大鼠软骨组织OARSI评分及滑膜组织Krenn评分明显升高（P＜0.05）,滑膜组织中巨噬细胞标志CD68、M1型极化指标iNOS明显升高（P＜0.05）、M2型极化指标CD206无明显变化（P＞0.05）,焦亡指标NLRP3、ASC、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）,滑膜纤维化指标TIMP1、VEGF、TGF-β蛋白水平明显升高（P＜0.05）,血清中疼痛相关指标SP、CGRP蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。3.与假手术组相比,KOA组中焦亡指标NLRP3、ASC、GSDMD、IL-1β蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）,滑膜纤维化指标TIMP1、VEGF、TGF-β蛋白水平明显升高（P＜0.05）,血清中疼痛相关指标SP、CGRP蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）,与KOA组相比,低浓度中药组大鼠滑膜组织中焦亡指标NLRP3、ASC、GSDMD、IL-1β蛋白水平,滑膜纤维化指标TIMP1、VEGF、TGF-β蛋白水平,血清中疼痛相关指标SP、CGRP蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）;与低浓度中药组相比,中浓度中药组各项指标均明显降低（P＜0.05）,与中浓度中药组相比,高浓度中药组各项指标均明显降低（P＜0.05）。4.与假手术组相比,KOA组中巨噬细胞标志CD68、M1型极化指标iNOS明显升高（P＜0.05）,M2型极化指标CD206无明显变化（P＞0.05）,焦亡指标NLRP3、ASC、GSDMD、IL-1β蛋白水平明显升高（P＜0.05）,滑膜纤维化指标TIMP1、VEGF、TGF-β蛋白水平明显升高（P＜0.05）,软骨组织OARSI评分及滑膜组织Krenn评分明显升高（P＜0.05）,血清中疼痛相关指标SP、CGRP蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。与KOA组相比,四神煎组和抑制剂组大鼠软骨组织OARSI评分及滑膜组织Krenn评分明显降低（P＜0.05）,滑膜组织中巨噬细胞标志CD68、M1型极化指标iNOS明显降低（P＜0.05）、M2型极化指标CD206明显升高（P＜0.05）,细胞焦亡指标、滑膜纤维化指标、血清中疼痛相关因子蛋白水平均明显降低（P＜0.05）,但抑制剂组和四神煎组之间各项指标并无明显差异（P＞0.05）。在用药后第7天,四神煎组和抑制剂组大鼠足阈值均明显高于KOA组（P＜0.05）,但低于假手术组（P＜0.05）,四神煎组和抑制剂组无明显差别（P＞0.05）;在用药后第14、21天,四神煎组和抑制剂组大鼠足阈值均明显高于KOA组（P＜0.05）,四神煎组、抑制剂组和假手术组之间足阈值无明显差别（P＞0.05）。结论:1.四神煎在改善KOA患者滑膜炎症、缓解关节疼痛方面疗效显著。2.KOA滑膜组织中巨噬细胞M1型极化可明显激活NLRP3/ASC信号通路,诱发巨噬细胞焦亡,加剧KOA滑膜炎症反应。3.四神煎可通过抑制巨噬细胞M1型极化,抑制巨噬细胞焦亡及下游炎症反应,改善KOA滑膜炎症及关节疼痛。