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背景:类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病,可导致进行性关节破坏、畸形和功能障碍。目前临床上治疗药物一定程度能减缓RA的进展,然而伴有诸多不良反应。传统中医在痹证治疗上有悠久的历史,中医药具有多靶点、高安全性等优势,或可从中开发寻找RA治疗的补充和替代药物。姜黄素具有抗炎、抗氧化等特性,具有良好的安全性,诸多研究表明,姜黄素在RA治疗中显示出较好的疗效。课题组前期研究发现,姜黄素可改善佐剂性关节炎大鼠关节炎症,抑制滑膜血管新生,并部分阐明了其作用机制。目的:本研究应用网络药理学方法和分子对接技术对姜黄素治疗RA的作用靶点和分子机制进行预测分析,并结合体内、体外实验验证,探讨姜黄素对RA干预作用的具体机制。方法:1.运用网络药理学方法预测姜黄素治疗RA的可能作用靶点和分子机制,获得姜黄素与RA的交集靶点;构建“药物—靶点—疾病”蛋白互作网络,筛选出姜黄素治疗RA的核心靶点,进行GO和KEGG富集分析,对核心靶点进行分子对接验证。2.选取2013年3月至2022年3月在东部战区总医院行膝关节手术的RA患者15例,为RA组,及同期行膝关节手术的关节损伤患者10例,为对照组。收集两组患者的滑膜组织病理标本及临床资料,对滑膜组织进行病理学观察,并进行滑膜病理评分;采用免疫组织化学染色技术检测磷酸化蛋白激酶（p-AKT）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白在滑膜组织中的表达情况,并与RA疾病活动指标之间进行相关性分析。3.体内研究部分,建立胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型,将DBA/1小鼠分为对照组（Control）、模型组（CIA）、姜黄素组（Curcumin）和甲氨蝶呤组（MTX）,每组各8只,按分组给药治疗。进行关节炎指数评分,苏木精—伊红（HE）染色观察小鼠滑膜病理形态,酶联免疫吸附测定（ELISA）检测各组小鼠血清肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6、IL-17的表达,原位末端标记法（TUNEL）染色检测小鼠滑膜组织细胞凋亡情况,免疫印迹法（Western-Blot）检测小鼠滑膜组织中磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT信号通路及凋亡相关蛋白的表达。4.体外研究部分,实验一:用TNF-α诱导MH7A细胞系建立RA体外模型,MMT法检测MH7A细胞活力的影响,观察不同浓度TNF-α、不同浓度Curcumin对MH7A细胞活力的影响,确定Curcumin的干预浓度。将MH7A细胞进行分组:Control组、TNF-α组（10 ng/mL TNF-α）、TNF-α+Curcumin 组（10 ng/mL TNF-α+50 μM Curcumin）。根据分组进行给药培养。EdU细胞增殖实验、平板克隆形成实验检测MH7A细胞增殖能力,细胞划痕实验、Transwell实验检测MH7A细胞的迁移和侵袭能力,Annexin-V法检测MH7A细胞凋亡情况,qRT-PCR检测MH7A中TNF-α、IL-6、IL-17的表达,Western Blot检测MH7A中MMP-2、MMP-9及凋亡相关蛋白、PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。实验二:运用胰岛素样生长因子1（IGF-1）激活PI3K/AKT信号转导的活性,观察其对MH7A细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白的影响。结果:1.通过Swiss Target靶点预测,获得姜黄素108个作用靶点;通过Genecards数据库,获得RA4465个疾病靶点;通过相互映射,获得姜黄素治疗RA潜在的71个靶点;构建以AKT1为主要核心靶点的蛋白互作网络。核心靶点主要有AKT1、TNF、EGFR、STAT3、MMP9等;通过GO和KEGG富集分析,显示了 GO生物功能以蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性为主,信号通路以PI3K/AKT信号通路为主;将姜黄素与AKT1进行分子对接模拟,姜黄素能稳定地对接到AKT1蛋白结构的活性口袋中,最优亲和力为-5.1 kcal/mol。2.RA组与对照组患者在年龄、性别方面无明显差异（P＞0.05）。RA组患者WBC、MONO、NEUT、CPR、RF、Anti-CCP 明显高于对照组（P＜0.05 或 P＜0.01）;RA 患者滑膜组织符合典型的滑膜炎特征,可见滑膜衬里层增生、炎性细胞浸润,RA组患者滑膜组织Krenn’s病理评分明显高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）。与对照组比较,RA组滑膜组织中p-AKT、Bcl-2、MMP-9的表达明显高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）。p-AKT的表达与 ESR（r=0.680,P=0.005）、DAS28-3（r=0.634,P=0.011）呈正相关;Bcl-2 的表达与 ESR（r=0.640,P=0.010）、CRP（r=0.584,P=0.022）呈正相关;MMP-9 的表达与 ESR（r=0.809,P==0.000）、DAS28-3（r=0.590,P=0.021）呈正相关。Bcl-2 与 MMP-9的表达呈正相关（r=0.630,P=0.012）。3.CIA组小鼠关节炎指数评分逐渐升高,Curcumin给药治疗后,自35d起,Curcumin组关节炎指数评分明显低于CIA组（P＜0.01）。Curcumin改善CIA小鼠滑膜组织炎性细胞浸润、滑膜衬里层增生、血管翳形成等病理表现。CIA组小鼠血清中TNF-α IL-6、IL-17的表达水平显著高于Control组（P＜0.01）,Curcumin组和MTX组小鼠血清中TNF-αIL-6、IL-17的表达水平显著低于CIA组（P＜0.01）。与CIA组相比,Curcumin组和MTX组滑膜细胞凋亡指数明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。Curcumin组和MTX组p-PI3K/PI3K和p-AKT1/AKT1比值较CIA组显著降低（P＜0.01）;与CIA组相比,Curcumin组小鼠滑膜组织中Bcl-2/Bax 比值显著降低（P＜0.01）;Curcumin组小鼠滑膜组织中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3的表达及Bcl-2/Bax 比值与MTX组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。4.体外实验一:TNF-α对MH7A细胞活力有促进作用,其中TNF-α浓度为10 ng/mL时,对MH7A细胞活力增加最为显著。Curcumin对MH7A细胞活力有抑制作用,呈剂量依赖性,计算半数抑制浓度IC50为50.68 μM,故选用50 μM作为后续实验中姜黄素的给药浓度。在MH7A中,与Control组相比,TNF-α组EdU 阳性率、克隆形成数、划痕愈合率、侵袭细胞数显著升高（P＜0.01）,细胞凋亡率明显降低（P＜0.05或P＜0.01）;与TNF-α组相比,TNF-α+curcumin组EdU 阳性率、克隆形成数、划痕愈合率、侵袭细胞数显著降低（P＜0.01）,细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）。与Control组相比,TNF-α组MH7A中TNF-α、IL-6、IL-17 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01）,与 TNF-α组相比,TNF-α+curcumin组 MH7A 中 TNF-α、IL-6、IL-17mRNA 的表达明显降低（P＜0.01）。与 Control 组相比,TNF-α组MH7A中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）;与TNF-α组相比,TNF-α+curcumin 组 MH7A 中 MMP-2、MMP-9 蛋白表达明显降低（P＜0.01）。与 Control组相比,TNF-α组MH7A中Bcl-2/Bax比值显著升高（P＜0.01）;与TNF-α组相比,TNF-α+curcumin 组 MH7A 中 Cleaved caspase-3 的蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）,Bcl-2/Bax 比值显著降低（P＜0.01）。与 Control 组相比,TNF-α组 MH7A 中 p-PI3K/PI3K、p-AKT1/AKT1 比值明显升高（P＜0.01）,与 TNF-α组相比,TNF-α+curcumin 组 MH7A中 p-PI3K/PI3K、p-AKT1/AKT1 比值明显降低（P＜0.01）。体外实验二:与Control组相比,TNF-α组中MH7A细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）;与TNF-α组相比,TNF-α+curcumin组MH7A细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）,TNF-α+curcumin+IGF-1组MH7A细胞凋亡率较TNF-α组升高,差异无统计学意义（P＞0.05）;与 TNF-α+curcumin 组相比,TNF-α+curcumin+IGF-1 组 MH7A 细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）。MH7A 细胞经 TNF-α诱导后,p-PI3K/PI3K 和 p-AKT1/AKT1 比值显著增加（P＜0.01）;经 Curcumin 干预后,p-PI3K/PI3K 和 p-AKT1/AKT1 比值较 TNF-α组显著降低（P＜0.01）;加入 IGF-1 后,p-PI3K/PI3K 比值较 TNF-α+curcumin 组显著增加（P＜0.01）,p-AKT1/AKT1比值较TNF-α+curcumin组稍有增加,差异无统计学意义（P＞0.05）。经TNF-α诱导后,MH7A中Cleaved caspase-3蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）,Bcl-2/Bax比值显著增加（P＜0.01）;经Curcumin干预后,与TNF-α组相比,MH7A中Cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）,Bcl-2/Bax 比值显著降低（P＜0.01）;加入IGF-1后,与 TNF-α+curcumin 组相比,Cleaved caspase-3 蛋白表达水平降低（P＜0.05）,Bcl-2/Bax比值显著增加（P＜0.01）。结论:1.RA患者滑膜组织中p-AKT、Bcl-2、MMP-9的表达增加,与RA疾病活动相关指标呈正相关。2.姜黄素通过抑制滑膜中PI3K/AKT信号的活化,降低Bcl-2/Bax 比值,增加caspase-3活性,从而改善了 CIA小鼠的关节炎症。3.姜黄素通过抑制PI3K/AKT信号途径诱导FLS细胞凋亡。