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[目的]多项研究表明,嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T Cell,CAR-T）在治疗恶性血液肿瘤中疗效明显,成为近年来最具潜力的肿瘤免疫疗法之一。但CAR-T细胞治疗实体肿瘤疗效欠佳,由于实体瘤复杂的肿瘤微环境屏障,及缺乏特异性肿瘤抗原使得CAR-T在实体瘤中的治疗效果受限。因此,寻找实体瘤合适的、高度特异表达的肿瘤抗原就十分重要。原癌基因人类表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）在众多恶性肿瘤中都有高表达,且目前较多研究表明,抗HER2 CAR-T对恶性肿瘤有较好的杀伤效果,在多种实体瘤中治疗有效。但是传统序列构建的抗HER2（赫赛汀抗体序列）CAR-T与靶细胞的特异性结合还不够强,容易有脱靶效应,并会引起细胞因子释放综合征,副作用较明显。因此,构建靶向性更好、副作用较轻的新序列抗HER2CAR-T,并探究其体内外功能就尤为重要。本研究在前期对抗HER2的不同抗体序列的优化和筛选中获得较优的新序列HER2-13/66的基础上,使用其scFv段序列构建第三代CAR-T细胞。目的是探究PiggyBac转座子系统电转构建两种新序列抗HER2-13/66 CAR-T细胞的方法,以及优化其体外扩增方式。并对抗HER2-13/66 CAR-T细胞表型进行检测,验证其体内外杀瘤活性;以上临床前研究数据,将为新序列HER2-13 CAR-T细胞用作自体细胞治疗产品服务于临床患者提供重要的科学依据与技术支持。[方法]1.新序列HER2-13/66CAR-T细胞构建与体外扩增体系的建立利用PiggyBac转座子方法,将新筛选出来的序列HER2-13 DNA和HER2-66 DNA质粒通过电转转染至外周血单核淋巴细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,采取较为成熟的磁珠刺激CAR-T细胞增殖扩增的方法,并在培养中按照比例添加所需要的外源性细胞因子,以加入磁珠作为第1天,在第13-16天根据CAR-T细胞增殖情况加入相应比例的嘌呤霉素（puromycin）筛选出电转上靶点的CAR-T细胞,在第19-24天终止培养,流式细胞学检测CD3+CAR+阳性率、CD4+CAR+和CD8+CAR+的表达。2.肿瘤靶细胞的构建及验证选择肺腺癌SPC-A-1细胞和乳腺癌SK-BR-3细胞、MDA-MB-231细胞做蛋白质免疫印迹技术实验（Western blot）验证HER2靶点的表达。其中SK-BR-3细胞过表达HER2靶点,而SPC-A-1细胞和MDA-MB-231细胞不表达HER2靶点,因此用带HER2靶点的慢病毒人工转染SPC-A-1细胞与MDA-MB-231细胞,再用Western blot技术验证人工转染靶点的SPC-A-1HER2和MDA-MB-231HER2靶点HER2是否表达阳性。若两株细胞HER2靶点表达阳性,则构建靶细胞成功。3.新序列HER2-13/66 CAR-T细胞体外功能验证收获扩增第19-24天的新序列HER2-13/66 CAR-T细胞,使其与野生型乳腺癌细胞MDA-MD-231,SK-BR-3及肺腺癌SPC-A-1,过表达HER2的SPC-A-1HER2、和MDA-MB-231HER2 5株细胞共同培养,使用CCK8试剂盒验证其体外杀瘤活性;对比两种新序列HER2-13/66 CAR-T杀瘤效应,选择杀瘤能力较强的CAR-T细胞做进一步功能验证。酶联免疫吸附实验（Elisa）检测CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养24小时后上清中释放的细胞因子;Western blot验证抗HER2-13 CAR-T细胞和肿瘤细胞共培养16-24小时后的相关凋亡蛋白及信号通路蛋白的检测;综合评估抗HER2-13 CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性及诱导细胞凋亡的机制。4.抗HER2-13 CAR-T细胞体内功能验证选用BALB/c裸鼠构建小鼠模型,在小鼠颈背部皮下注射SPC-A-1HER2细胞,待小鼠瘤体长至大约50 mm3,采用随机分组的方式,分为抗HER2-13 CAR-T治疗组、NT对照组,空白对照组;选用尾静脉注射方法,分别注射抗HER2-13 CAR-T细胞至治疗组,NT细胞至对照组,生理盐水至空白对照组,观察治疗组小鼠和对照组小鼠体重及瘤体大小变化,探究三组小鼠肿瘤细胞的CAR-T浸润情况、肿瘤增殖情况、肿瘤凋亡情况。从而评估抗HER2-13 CAR-T细胞在小鼠体内的抗肿瘤活性。[结果]1.新序列H[ER2-13/66 CAR-T细胞体外扩增体系的建立经过19-24天的体外培养,利用磁珠刺激CAR-T细胞增殖,同一样本来源的新序列HER2-13/66 CAR-T的增殖情况:抗HER2-13 CAR-T细胞扩增可达22倍;抗HER2-66 CAR-T细胞扩增可达12.49倍。抗HER2-66 CAR-T细胞CD3+CAR+表达率 50.28%;抗 HER2-13 CAR-T 细胞 CD3+CAR+表达率 75.92%±1.99%,CD4+CAR+表达率 8.47%±6.09%,CD8+CAR+表达率 68.34%±0.16%。可见此种培养体系扩增能力强、阳性率高、重复性好、稳定性强。2.肿瘤靶细胞的构建及验证Western blot检测显示,乳腺癌SK-BR-3细胞过表达HER2靶点,乳腺癌MDA-MB-231细胞和肺腺癌SPC-A-1细胞不表达HER2靶点,经过人工转染HER2靶点过后,Western blot 验证 MDA-MB-231HER2和SPC-A-1HER2HER2靶点表达阳性。3.新序列HER2-13/66 CAR-T细胞体外功能验证3.1 新序列HER2-13/66 CAR-T细胞的抗肿瘤活性验证新序列 HER2-13/66 CAR-T 细胞对 SK-BR-3、SPC-A-1HER2、SPC-A-1、MDA-MB-231HER2、MDA-MB-231五种细胞具有高效杀伤性。且人工表达HER2阳性的SPC-A-1HER2、MDA-MB-231HER2的杀伤能力比HER2表达阴性SPC-A-1、MDA-MB-231强,具有显著靶向性;此外,对天然过表达HER2的SK-BR-3细胞的杀伤作用强于人工表达HER2的MDA-MB-231HER2细胞,并且对这5种细胞的杀伤作用随效靶比（2:1、4:1、8:1、16:1）的递增而增强,具有剂量依赖性。还发现,抗HER2-13 CAR-T细胞对这5种肿瘤杀伤能力强于抗HER2-66 CAR-T细胞。3.2 抗HER2-13 CAR-T与肿瘤共培养后上清中的细胞因子检测抗HER2-13 CAR-T细胞与肿瘤细胞的共培养上清较NT细胞与肿瘤细胞共培养的上清不仅表达更多的穿孔素、颗粒酶B及IFN-γ,还表达如IL-10、IL-2、TNF-α等一系列细胞因子。并且抗HER2-13 CAR-T细胞与表达HER2阳性的肿瘤细胞共培养后分泌的杀伤作用的细胞因子（穿孔素、颗粒酶B、IFN-y）较HER2表达阴性的肿瘤细胞共培养分泌得更多,采用双方向方差检验分析（Two-way ANOVA）P<0.05,有统计学意义。3.3抗HER2-13 CAR-T与肿瘤共培养后相关凋亡蛋白检测抗HER2-13 CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞较NT细胞杀伤肿瘤细胞时,Westem blot实验检测相关凋亡蛋白及可能涉及的信号通路蛋白。结果发现:STAT1、STAT2、Bax、Bad、cleaved-caspase3 的表达量增加。因此抗 HER2-13 CAR-T 细胞可能通过激活IFN-γ/STAT1,STAT2和凋亡信号通路来激活免疫细胞的凋亡信号通路发挥杀伤活性,体现免疫细胞抗肿瘤作用。4.抗HER2-13 CAR-T细胞体内功能验证BALB/c裸鼠构建肺腺癌SPC-A-1HER2小鼠模型,抗HER2-13 CAR-T治疗组相对于NT对照组小鼠体重无显著差异,但瘤体体积与瘤重明显减小,在注射效应细胞16天,治疗组瘤体体积与对照组对比减小,具有统计学差异。抗HER2-13 CAR-T细胞能够迁移归巢到移植瘤中,并通过诱导凋亡,减少增殖发挥抑制肿瘤生长的作用。[结论]1.利用PiggyBac转座子电转构建新序列HER2-13/66 CAR-T细胞,结合磁珠刺激CAR-T细胞增殖的方法能够实现CAR-T细胞的大量扩增,方法稳定性好、重复性强、扩增纯度高。抗HER2-13 CAR-T细胞增殖能力大于抗HIER2-66 CAR-T细胞,且CD3+CAR+表达率也较高。2.抗HER2-13 CAR-T细胞与抗HER2-66 CAR-T细胞可靶向性的杀伤肿瘤细胞,且前者对包括肺腺癌SPC-A-1、SPC-A-1HER2和乳腺癌SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-231HER2 细胞的杀瘤活性强于抗 HER2-66 CAR-T 细胞。3.抗HER2-13 CAR-T细胞主要通过释放穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ、GM-CSF、IL-2,IL-10和TNF-α等激活STAT和凋亡相关通路来杀伤肿瘤细胞。4.经过抗HER2-13 CAR-T细胞治疗的SPC-A-1HER2 BALB/c裸鼠瘤体相比于对照组减小,抗HER2-13 CAR-T细胞具有良好的体内抗肿瘤活性。